Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die Gruppe zwei der angeborenen lymphatischen Zellen aus der Nasenschleimhaut der Maus zu isolieren und zu identifizieren und die bestimmten Wirkungen und zugrunde liegenden Mechanismen der ILC two bei Nasenerkrankungen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht es den Forschern, ILC two aus lokalem Mesothel zu isolieren und die Expression des Oberflächenantigens mittels Durchflusszytometrie freizulegen. Unsere Technik beinhaltet keine komplizierten Operationen.
Eine wichtige Sache ist jedoch, zu versuchen, das Fleisch, das an den kleinen Knochen haftet, vollständig zu entfernen, um den Aufprall anderer Gewebe in der Nähe zu vermeiden. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, halten Sie sechs männliche und weibliche Mäuse vom Wildtyp C57 im Alter von 8 bis 12 Wochen unter bestimmten pathogenfreien Bedingungen mit Standard-Laborfutter und Wasser unter. Um das Modell der allergischen Rhinitis zu etablieren, werden 50 Mikrogramm Ovalbumin in 0,2 Millilitern sterilem PBS, das zwei Milligramm Aluminiumhydroxid enthält, emulgiert und jeder Maus an null, sieben und 14 Tagen 50 Mikrogramm emulgiertes Ovalbumin intraperitoneal injiziert. An den Tagen 21, 22, 23, 24 und 25 wurden Mäusen 50 Mikrogramm Ovalbumin, gelöst in 30 Mikrolitern sterilem PBS, intranasal instilliert, gefolgt von der Euthanasie der Mäuse 24 Stunden nach der letzten Challenge.
Weichen Sie den Kopf der euthanasierten Maus fünf Minuten lang in 75%igem Ethanol ein und vermeiden Sie, dass Ethanol in das äußere Nasenloch gelangt. Legen Sie den Bauch nach unten auf den Operationstisch. Schneiden Sie die vier Zähne ab und machen Sie an der Mittellinie des Kopfes einen Schnitt und schneiden Sie die Haut mit einer Schere auf.
Entfernen Sie dann den Unterkiefer, schneiden Sie die gesamte Nase am Ende des Gaumens ab und legen Sie das Gewebe in eine 60-Millimeter-Petrischale mit fünf Litern eiskaltem PBS. Entfernen Sie mit Schere und Pinzette das Fleisch und die Muskeln, die an den Knochen haften. Als nächstes überführen Sie die Mausnase in eine neue 60-Millimeter-Petrischale mit fünf Millilitern eiskaltem PBS und waschen die Knochen.
Nach dem zweiten Waschgang die Nase in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführen. Zerdrücken Sie das Gewebe ausreichend und geben Sie es in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern vorgewärmtem Verdauungspuffer. Schließen Sie den Deckel und legen Sie das Röhrchen 40 Minuten lang senkrecht in einen Orbitalschüttler bei 37 Grad Celsius und 120 bis 150 U/min.
Als nächstes fügen Sie fünf Milliliter eiskaltes RPMI 1640-Medium hinzu, das 10 % fötales Kälberserum enthält, um die Verdauung zu stoppen. Filtern Sie dann den Inhalt durch ein 70-Mikron-Zellsieb, um feste Fragmente zu entfernen. Nachdem Sie das Filtrat fünf Minuten lang bei 500 G zentrifugiert haben, verwerfen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet in eiskaltem RPMI 1640-Medium.
Um die Zentrifugation wie zuvor gezeigt zu wiederholen, resuspendieren Sie das Zellpellet in vier Millilitern Gradientenmedien mit 40%iger Dichte. Führen Sie als Nächstes vorsichtig eine Pasteurpipette auf den Boden des Röhrchens ein, um 2,5 Milliliter Gradientenmedien mit 80 % Dichte hinzuzufügen. Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 400 G für 15 Minuten bei Raumtemperatur, wobei die Beschleunigungs- und Verzögerungsrate niedriger als im dritten Gang eingestellt ist.
Bevor Sie die Zellen an der Grenzfläche entleeren, entfernen Sie die oberste Schicht von Verunreinigungen, um eine mögliche Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie dann eine Pipette, um die Schicht der mononukleären Zellen an der Grenzfläche des Gradientenmediums mit einer Dichte von 40 % x 80 % in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit zwei Millilitern eiskaltem Medium zu entwässern. Waschen Sie die Zellen zweimal mit eiskaltem PBS.
Ernten Sie die Zellen und zentrifugieren Sie sie fünf Minuten lang bei 500 G bei vier Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Zellpellet im Färbepuffer und zentrifugieren Sie es erneut fünf Minuten lang bei 500 G.Entsorgen Sie den Überstand. Resuspendieren und inkubieren Sie die Zellen in 80 Mikrolitern Blockierlösung für 30 Minuten bei vier Grad Celsius im Dunkeln.
Fügen Sie einen Mikroliter fixierbaren Viabilitätsfarbstoff 520 hinzu, bevor Sie der Probe 20 Mikroliter des oberflächenfärbenden Antikörpercocktails der entsprechenden Verdünnung hinzufügen. Legen Sie außerdem die passenden Isotyp-Antikörper und die Fluoreszenz minus eins als Negativkontrollen fest. Als nächstes waschen Sie die Zellen in 500 Mikrolitern Färbepuffer, indem Sie sie fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 500 x G zentrifugieren.
Anschließend wird das Zellpellet in 200 Mikrolitern Färbepuffer resuspendiert. Zum Schluss geben Sie 50 Mikroliter vortexed absolute Zählkügelchen zu den gefärbten Zellen. Rühren Sie sie um und unterziehen Sie sie einer durchflusszytometrischen Analyse.
Ein eistoffinduziertes Mausmodell, das entwickelt wurde, um die Rolle der angeborenen lymphatischen Zellen der zweiten Gruppe zu untersuchen, zeigte, dass die Häufigkeit von Nasenreiben und Niesen bei den Mäusen mit allergischer Rhinitis signifikant höher war als in der Kontrollgruppe. In der Nasenschleimhaut gesunder Kontrollmäuse wurden etwa 2 bis 3 % der liniennegativen und CD 45-positiven Zellen identifiziert. Die absolute Anzahl der angeborenen lymphatischen Zellen der zweiten Gruppe variierte zwischen 2.000 und 4.000.
Die durchflusszytometrische Analyse zeigte einen bemerkenswerten Anstieg der Gesamtzahl der angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe zwei in der allergischen Rhinitis-Nasenschleimhaut im Vergleich zu gesunden Kontrollmäusen. Eine höhere Expression von CD 226 wurde auf den angeborenen lymphatischen Zellen der Gruppe zwei in den allergischen Rhinitis-Mäusen nachgewiesen als in den Kontrollmäusen. Zudem war die mittlere Fluoreszenzintensität von CD 226 in den AR-Mäusen signifikant hochreguliert.
Achten Sie auf die Schritte zum Entfernen des am Nasenbein haftenden Fleisches, zum Einstellen der Beschleunigungs- und Verzögerungsrate beim Zentrifugieren des Mediums und zum Entleeren der mononukleären Zellen. Die identifizierten ILC twos können ein Ständer für die durchflusszytometrische Charakterisierung sein, die für Zellkulturen sortiert oder in vitro stimuliert wird, was dazu beitragen würde, das spezifische Risiko von ILC twos im Nasengewebe zu untersuchen. Dieses Verfahren zur Isolierung und Charakterisierung von Lymphozyten, insbesondere in angeborenen lymphatischen Zellen in der Nasenschleimhaut, macht dieses Protokoll zu einer vorläufigen Referenz für Forscher, die die lokale nasale Immunumgebung untersuchen.
