Protokol, geleneksel cerrahi ve kör enjeksiyon yöntemlerine doğru, güvenli ve etkili bir cerrahi olmayan alternatif sunar. Aynı zamanda yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde atrofi timusları için en doğru enjeksiyon tekniğidir. En önemli avantajı, çok güvenli ve hassas, aynı zamanda hızlı olan minimal stresli bir enjeksiyon prosedürüdür, böylece cerrahi strese bağlı immünsüpresyondan veri ödün vermeden büyük ölçekli deneylere olanak tanır.
İğnenin ve dönüştürücünün hizalanmasını sağlarken göğüs duvarından ilerletmek biraz pratik gerektirir. Bu nedenle, enjeksiyon yapmak veya eğitim vermek için deneyimli bir girişimsel radyolog ile işbirliği yapmanızı öneririz. Prosedürün gösterilmesine yardımcı olacak kişi, laboratuvarımdan bir teknisyen olan Shaina Anuncio olacak.
Başlamak için, kürkü çıkarmak için farelerin ön göğüs bölgesine bir dakikadan az bir süre boyunca ince bir tüy dökücü krem tabakası uygulayın. Kremayı ve gevşek kürkü çıkarmak için ıslak bir kağıt havlu kullanın. Arka pençe sıkışmasına yanıt vermeyerek uygun anestezik derinliği onaylayın.
Kornea kurumasını önlemek için her iki göze de oftalmik merhem uygulayın. Burun konisi yerinde olacak şekilde küçük hayvan ultrason görüntüleme istasyonunun ısıtılmış platformunda sırtüstü pozisyonda her seferinde bir fare yerleştirin. Fareyi arka ve ön bacaklarda tıbbi yapışkan bantla sahneye sabitleyin.
Kürksüz üst toraks derisini bir klorheksidin glukonat aplikatörü kullanarak dezenfekte edin. Mevcut en yüksek frekanslı lineer probu etkinleştirin. Tipik olarak, görüntülenen hayvanın büyüklüğü için en yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip prob.
Başlatma ekranından sonra ilgili düğmeye dokunarak probu etkinleştirin. Görüntüleme ve enjeksiyon için ultrason ayarlarını optimize etmek amacıyla, ekranın sağ tarafındaki dikey yönelimli kaydırıcıları ayarlayarak görüş alanının derinliğini hedef hayvan için uygun bir boyuta ayarlayın. Düğmeyi ekranın altındaki yatay çubuk boyunca kaydırarak gri tonlama kazancını ayarlayın.
Ardından, odak bölgesini timusun beklenen seviyesine ayarlayın. Dönüştürücü yüzeyine, ultrason makinesi tutucusunda veya bir asistanın elinde dururken, dik durumdayken yaklaşık bir mililitre ultrason jeli uygulayın. Isıtılmış platformun yanında küçük bir steril alan hazırlamak için, steril bir prob kapağını, lastik bandı, steril eldivenleri ve steril ultrason jelini steril alana boşaltın.
Ardından, steril eldivenleri giyin. Steril prob kapağını ultrason dönüştürücü ve jel üzerine dikkatlice yerleştirin. Steriliteyi korumak için sadece steril kapağa dokunun.
Steril lastik bandı yerinde tutmak için prob kapağının üzerine kaydırın. Transdüserin üzerine iki ila üç mililitre steril ultrason jeli yerleştirin. Ultrason jel kaplı probu, steriliteyi korurken, ilk görüntüleme için farenin ön göğüs duvarının dezenfekte edilmiş kısmına dikey olarak yerleştirin.
Ultrason görüntüsünü daha önce gösterildiği gibi görüntüleyin ve optimize edin. Farenin ön göğsünü enine bir düzlemde taramak için, dönüştürücüyü dikey olarak tutun ve boya fırçası benzeri veya süpürme hareketiyle boyundan karnına yukarı ve aşağı hareket ettirin. Kalp görüş alanında ortalanmışken, dönüştürücüyü hafifçe boyuna doğru süpürün.
Üst göğsün her iki tarafındaki iki yuvarlak eşleştirilmiş siyah yapıya dikkat edin. Ultrason probunu kullanarak, genellikle enjeksiyon için ideal hedef bölge olan timusun en geniş kısmını bulun. Seçilen yerde yatay bir iğne yörüngesi öngörün ve ana kan damarlarının bu bölgede nerede bulunduğunu not edin.
Enjeksiyon sırasında bu damarlardan kaçınılmalıdır. Kan damarları hipoekoik pulsatil yapılar olacaktır. Emin değilseniz, damarlardaki akışı kontrol etmek için ekrandaki renk düğmesine dokunarak renkli Doppler modunu etkinleştirin.
Transdüseri bir elinizde tutun ve diğer elinizde 10 mikrolitre enjekte edilen 30 gauge insülin iğnesini tutun. Enjeksiyon işlemine başlamak için, transdüseri yanal olarak hareket ettirin, böylece timus ultrason görüş alanında merkezden uzakta olur. Görüş alanının diğer tarafının çoğunlukla ultrason jelinden ve başka hiçbir şeyden oluşmadığından emin olun.
İğnenin ucunu dönüştürücünün altındaki jele yerleştirin ve iğneyi cilt yüzeyine bitişik olarak görselleştirilene kadar yavaşça hareket ettirin. İğneyi ultrason altında sürekli görüntülerken, iğneyi kan damarlarından uzakta perkütan bir yörünge ile timus bezine yerleştirin. İğne ucunu giriş bölgesine aykırı timik loba yerleştirmek için çapraz timus yatay yörüngesi kullanın.
İğne ucu timusun istenen kısmının içine girdikten sonra, sonografik görselleştirme kullanırken içeriği 30 gauge şırıngadan hızlı bir şekilde enjekte edin. İğne yerleştirme ve enjeksiyon sırasında şırıngayı stabilize etmek için, şırıngayı baş parmak ile üçüncü parmak arasında tutun ve şırınga pistonunu işaret parmağıyla kontrol edin. Tüm içerikler yatırıldıktan sonra iğneyi çıkarın.
Genç farelerde, timus bezinin tanımlanması, bezin büyüklüğü nedeniyle basitti. Yaşlı veya immün yetmezlikli farelerde daha zordu. Bununla birlikte, modern ultrason ekipmanı ile hala çok mümkündü.
İğne, kalp, aort veya inferior vena kavalardan biri gibi kritik yapıları geçmediğinde başarılı enjeksiyon kaydedildi. İğne ucu, enjeksiyon sırasında hedef konumunda görselleştirildi ve intratimik birikimi doğruladı. Enjeksiyonun intratimik yeri, Luciferin'i lusiferaz transgenik farelere enjekte olarak kullanarak doğrulandı.
Bunlar hemen biyolüminesans görüntüleme ile değerlendirildi ve hayvanı feda etmeden enjeksiyonun doğru yerini doğruladı. Alternatif olarak, Trypan Blue, enjeksiyon bölgesinin görsel bir belirteci olarak enjekte edildi ve nekropsi ile ex vivo kullanılarak enjeksiyon doğruluğu enjekte edildi. Grubumuz bu tekniği, genetiği değiştirilmiş progenitör hücrelerin enjeksiyonuna dayanan kanser immünoterapi araştırmaları da dahil olmak üzere birçok büyük çalışma için ve immün yetmezlikli farelerde timik fonksiyonu iyileştirmek için kullanmaktadır.
