Bu protokol, bu germ hücreleri üzerindeki gen ekspresyon analizlerini değerlendirmek için yumurtalık foliküllerini çevreleyen stroma hücrelerinden izole etmek için etkili bir yöntem tanımlamaktadır. Kontrollü enzimatik ve mekanik izolasyonlar kullanan bu teknik, foliküllerin bütünlüğünü korurken geri alınmasına izin verir. Bu protokolü takiben, araştırmacı bu hücrelerden spesifik gen ifadelerini değerlendirebilir.
Bu teknik, yumurtalık fonksiyonunu etkileyen hastalıklarla ilgili foliküllerde veya toksik ajanlara maruz kaldıktan sonra gen ekspresyonunun eksikliğini daha iyi anlamak için kullanılabilir. İlk kuyucuğa beş mililitre kriyoprotektan çözeltisi ve sonraki dört kuyucuğa azalan kriyoprotektan konsantrasyonları ile beş mililitre Leibovitz 15 ortamı ekleyerek altı kuyucuklu bir plaka hazırlamaya başlayın. Yumurtalık kortikal parçası içeren bir şişeyi güvenlik kurallarına uygun olarak sıvı azottan çıkarın.
Oda sıcaklığında veya RT'de 30 saniye sonra, şişeyi iki dakika boyunca çift damıtılmış suya batırın. Dikey bir davlumbazın içinde, içeriği buz üzerine yerleştirilmiş altı delikli plakanın ilk kuyucuğuna aktarmadan önce yumurtalık kortikal parça şişesini hafifçe çalkalayın ve açın. Daha sonra, ilk kuyucuktaki yumurtalık kortikal fragmanını, beş mililitre Leibovitz 15 ortamında azalan kriyoprotektan konsantrasyonları içeren altı kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna art arda aktarın.
Her ortamdaki dokuyu beş dakika boyunca hafifçe çalkalayın. Folikül izolasyonu için, çözülmüş yumurtalık dokusunu 10 mililitre diseksiyon ortamı, mililitre penisilin G başına 30 mikrogram ve mililitre streptomisin başına 50 mikrogram ile doldurulmuş iki milimetrelik ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Gerekirse doku boyutunu neşterle ayarlayın.
Doku dilimleyicinin üç parçasını yığın ve yumurtalık parçasını iki blok arasına yerleştirin. 0,5 milimetre kalınlığında iki parça elde etmek için bloklar arasında kayarak bir bıçak kullanarak parçayı ikiye bölün. Daha küçük parçaları elde etmek için doku doğrayıcıyı kullanarak dokuyu kesin.
Gerekirse, doku parçalanana kadar kalan parçaları neşterle manuel olarak kesin. Doku parçalandıktan sonra, parçalanmış dokuyu, kabı% 5 karbondioksit ve 37 santigrat derecede inkübatöre yerleştirmeden önce yedi mililitre sindirim ortamı ile doldurulmuş ızgaralı bir Petri kabına aktarın. Petri kabını inkübatörden her 10 dakikada bir alın.
Sindirim ortamını bir mililitrelik pipetle yukarı ve aşağı pipetleyerek dokuyu yıkayın. Sindirim ortamında 45 dakikalık inkübasyondan sonra, çanağı beş ila 6,3 kat büyütme aralığına sahip bir stereo mikroskop altına yerleştirin ve bir mikro kılcal pipet kullanarak folikülleri alın. İlgilendiğiniz folikülleri seçin ve bir ağız pipeti ile emerek izole edin.
Foliküller bir korteks parçasında sıkışıp kalırsa, korteksi şırıngaların ucuyla sökerek ve folikülleri stromadan serbest bırakarak iki adet 27 gauge şırınga ile mekanik olarak izole edin. Mikro kılcal damarı kullanarak, izole edilmiş folikülleri, 500 mikrolitre yağ kültürü ile kaplanmış kalibre edilmiş kültür ortamının 15 mikrolitresini içeren dört kuyucuklu bir plakaya aktarın. Bir ila 10 folikül aktardıktan sonra, her biri beş saniye boyunca 500 mikrolitre yağ kültürü ile kaplanmış iki damla 15 mikrolitre PBS damlasında iki kez durulayın.
Ağız pipetini kullanarak, boş bir tüpte minimum PBS ile 20 folikül toplayın ve tüpü buz üzerinde tutun. Sindirim ortamında 90 dakikalık inkübasyondan sonra, soğuk bloke edici bir çözelti ekleyerek enzimatik reaksiyonu durdurun. Kimyasal kaputun altında, izole edilmiş folikülleri, RNA Ekstraksiyon Kiti ile birlikte verilen lizis çözeltisinin 100 mikrolitresinde askıya alın.
Yapılarını kırmak için izole edilmiş folikülleri dakikada 2500 RPM'de vorteksleyin, ardından tüpe 50 mikrolitre% 100 etanol ekleyin. Ve kısaca tüpü yüksek hızda vorteks. Vortekslemeden sonra, tüpün toplam hacmini bir sütun ve bir toplama tüpünden oluşan bir mikro filtre kartuşu tertibatına aktarın.
Ve tertibatı 16'da 10 saniye boyunca santrifüjleyin, dört santigrat derecede 363g. Tüpü 10 saniye boyunca santrifüj etmeden önce kolonu kit ile birlikte verilen 180 mikrolitre Yıkama Çözeltisi 1 ile yıkayın. Kolona 180 mikrolitre Yıkama Çözeltisi 2, 3'ün iki yıkamasını verdikten sonra, tüpü son bir kez santrifüj ederek filtreyi kurutun ve kartuşun altına yeni bir toplama tüpü yerleştirin.
Nükleik asitlerin elüsyonunu gerçekleştirmek için, önce filtre tertibatına sekiz mikrolitre 75 santigrat derece Elüsyon Çözeltisi ekleyin. Bir dakika sonra, tertibatı 30 saniye boyunca santrifüj edin. Bu adımı yedi mikrolitre Elüsyon Çözeltisi ile tekrarlayın.
Tamamlandığında, tüpe iki uluslararası birim DNaz ve DNaz tamponu ekleyin ve tüpü 37 santigrat derecede 20 dakika boyunca inkübe edin. Enzimatik aktiviteyi oda sıcaklığında iki dakika boyunca bir x 10 DNaz inaktivasyon reaktifi ile bloke edin. Daha sonra, tüpü 16'da 1.5 dakika, dört santigrat derecede 363 g'da santrifüj edin ve RNA'yı içeren süspansiyonu yeni bir tüpe aktarın.
Bir spektrofotometre kullanarak, numunedeki RNA miktarını değerlendirin. İzole foliküllerden ekstrakte edilen bir mikrolitre Elüsyon Çözeltisini boş ve bir mikrolitre RNA çözeltisi olarak kullanın. RNA saflığı için 260/280 oranının 2.0 civarında olup olmadığını kontrol edin.
Numuneyi eksi 80 santigrat derecede saklayın veya RT-qPCR gerçekleştirmek için doğrudan geriye doğru transkripte edin. Bu protokol kullanılarak, aynı hastadan 4x2x1 milimetrelik iki homojenize yumurtalık parçası, folikülleri izole etmek için işlendi. RNA nicelleştirmesi, toplam RNA'nın mikrolitresi başına 4.8 nanogramının, 1.89 saflık oranına sahip 75 mikrometreden küçük foliküllerden çıkarıldığını ortaya koymuştur.
200 mikrometreden az folikülden, toplam RNA'nın mikrolitresi başına 10.5 nanogram, 1.74 saflık oranıyla ekstrakte edildi. RNA bütünlük numarası veya RIN değerleri, örneklerimizden RNA'nın kalitesini doğrulayan bir ve iki tüpte sırasıyla 7.1 ve 7.9 idi. Gerçek zamanlı bir PCR sisteminde standart bir döngü çalıştırdıktan sonra, elde edilen döngü eşikleri veya BT, HPRT için 30.87 ve 29.56, kit ligand için 33.5 ve 31.77 ve GDF9 için 30.71 ve 30.57 idi.
Dokunun enzimatik sindirimi kritik bir noktadır. Deneyci, reaksiyon sırasında folikül bütünlüğünü sürekli olarak değerlendirmeli ve gerektiğinde durdurarak sağlamalıdır. Gen ekspresyon analizlerinin yanı sıra, izole foliküller, folikül in vitro kültür veya yapay yumurtalık gibi kanser hastalarının doğurganlığını korumak için deneysel sistemler geliştirmek için kullanılır.
İzolasyon tekniği, çok sayıda sağlam folikülü almak için bir öğrenme eğrisi gerektiriyordu. Araştırmacılara, sindirimden önce dokunun iyi parçalandığından emin olmaları önerilir.
