Bu araştırma, apendiks kanseri terapötikleri ve patobiyolojisinin preklinik bir ortamda incelenmesine yeni bir yaklaşım göstermektedir. Bu yöntemler diğer malignitelerin incelenmesi için daha geniş çapta uygulanabilir olabilir. Apendiks kanseri, hastalık modellemesi için farelerde bir apendiks yokluğunda düşük insidansı göz önüne alındığında çalışmak zordur.
Bu teknik, tümör mikro ortamındaki hücre etkileşimlerinin incelenmesine izin verir. Bu yöntem, kolorektal ve yumurtalık kanserleri gibi omentuma metastaz yapma eğilimi olan çoklu kanser türlerinin biyolojisini incelemek için uygulanabilir. Ulaşım ve kültür medyasını hazırlayarak başlayın.
Doku varışında, psödomiksoma peritonei tümör dokularını altı santimetre çapında kaplar içeren 35 tam DMEM'ye aktarın. Herhangi bir sıvılaştırılmış müsin veya yüksek derecede müsinöz doku bölgelerini çıkarmaya ek olarak, bir neşterle kesilmesi zor olan herhangi bir dokuyu çıkarın. Tümör dokusu nodüllerini kabaca bir küp santimetre daha küçük parçalara ayırın.
agaroz hazırlığı ve doku gömme için, dokular gelirse aynı gün içinde fetal sığır serumu veya FBS olmadan PBS'de% 5'lik bir düşük erimeli agaroz çözeltisi hazırlayın. Sıvı% 5 agaroz çözeltisini, numuneyi kaplayana kadar iki ila üç küçük tümör örneği içeren altı santimetrelik kaplara ekleyin. Gömülü mendilleri 30 dakika boyunca dört santigrat derecelik bir buzdolabına yerleştirin.
Doku örneklerini vibratom üzerinde sökün, katılaşmış burguyu buzdolabından çıkarın ve agaroz küplerini bir neşter kullanarak dokunun genişliğinden biraz daha büyük kesin. Vibratom aşamasına süper yapıştırıcı uygulayın ve agaroz küpünü sabitlemek için bir ila iki dakika boyunca süper yapıştırıcının üzerine yavaşça yerleştirin. Bıçağı vibratoma sabitleyin ve optimum aşağı akış görüntülemesi için doku bölümünün kalınlığını kabaca 150 ila 250 mikrona ayarlayın.
Doku dilimlerini kültüre almak için, geçirgen membranın üzerine iki mililitre tam DMEM ortamı ve geçirgen membranın altına üç mililitre ekleyerek geçirgen bir kesici uç plakası hazırlayın. Daha sonra, doku dilimlerini ince bir boya fırçası kullanarak vibratomun kesme odasından yavaşça kaldırın ve iki ila dört dilimi tam DMEM içeren geçirgen kültür kaplarına yerleştirin. Dilimleri% 5 karbondioksit içinde 37 santigrat derecede yedi güne kadar kültürleyin.
Medya replasmanı sırasında, her 24 saatte bir, hücre öldürme kontrolleri olarak bortezomib ve farmakolojik müdahale gerçekleştirmek için kültür ortamına test edilebilir kemoterapiler 5-Florourasil veya 5-FU ekleyin. Konfokal görüntüleme analizi için tümör dilimlerini,% 1 FBS ile PBS içeren 12 delikli bir kabın tek bir kuyucuğuna yerleştirin. Kalsiyum görüntüleme deneyleri için, PBS yerine, dilimleri ekstra bir hücresel kalsiyum çözeltisinde inkübe edin.
Doku dilimlerinin yaşayabilirliğini belirlemek için görüntüleme boyaları ile numuneleri lekeleyin. Canlılık boyasını ekledikten sonra 10 dakika ila bir saat arasında inkübe edin. İnkübasyondan sonra, dilimleri konfokal bir görüntüleme cihazında görüntüleme için kullanılmak üzere% 1 FBS içeren PBS içeren optik olarak berrak bir cam tabanlı Petri kabına aktarın.
Açıklığı genişletmek için bir mililitrelik pipet ucunun ucundan küçük bir parça keserek pipetleme ile güçlü mekanik ayrışmaya izin verin. Bir mililitre sindirim tamponunda beş ila 15 dakika boyunca rotasyonla 37 santigrat derecede dilimleri inkübe edin, mekanik ayrışma kullanarak inkübasyon sırasında iki ila üç kez kuvvetli doku bozulması ile. Doku sindirildikten sonra, bozulmuş dokuyu sindirim ortamı ile 50 mililitrelik bir konik tüpün üzerine yerleştirilmiş 70 mikrometrelik bir filtreye aktarın.
Steril forseps veya pipet kullanarak daha büyük parçalar seçin. Plastik beş mililitrelik bir şırınganın künt arka ucunu kullanarak, daha büyük ayrışmamış dilimleri ezin ve% 2 FBS içeren dört mililitre PBS ile yıkayın. Ayrışmış hücre süpernatantını alın ve beş ila 10 dakika boyunca 300G'de santrifüj.
Süpernatantı çıkarın ve peleti% 2 FBS içeren bir mililitre PBS ile yıkayın. Numuneyi akış sitometrisine hazırlamak için, 50 mikrolitre insan FC bloğu içeren bloke edici tamponu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika boyunca inkübe edin. %2 FBS içeren 50 mikrolitre PBS'de ilgili antikorları kullanarak ekstra hücresel boyama yapın.
Kontrol ve tedavi koşulları için beş mililitre komple ortam aliquot. Geçirgen tabakların üzerine kaplanmış iki ila dört dilim üzerine, kontrol tedavisi alikotlarından gelen ortamı ve aşağı akış canlılığı, canlı ölü analizi için kullanılacak ek kombinasyon terapilerini ekleyin. Doku dilimlerini iki ila beş gün boyunca tam DMEM içeren bir kültürde bırakın, medyayı ve her gün bortezomib ve 5-FU'yu değiştirin.
Işıldayan canlılık analizi için, 12 delikli bir kaba 500 mikrolitre PBS ekleyin ve sırayla eşleşen doku dilimlerini bir boya fırçası veya bir mililitre pipet kullanarak PBS çözeltisine aktarın. PBS'yi dilimlerden çıkarın. Koşul başına 500 mikrolitre ışıldayan canlılık çözeltisi ekleyin ve bir lüminesans plakası okuyucu kullanarak lüminesansı okumadan önce 30 dakika boyunca çalkalayıcı üzerinde 30 dakika boyunca yavaş bir dönüşle inkübe edin.
Doku dilimlerindeki müsin boyaması, periyodik asit kayması boyaması ve müsin spesifik antikorlar kullanılarak görselleştirildi. Kalsein ve propidium iyodürdeki inkübasyon sağlık ve canlılığı belirledi. Çekirdekler üst üste bindi, hücreler kültür sırasında çoğaldı.
Bu sonuçlar, tümör dilimi içindeki çoğalan hücrelerin sayısını belirlemek için nicelleştirildi. CD11b PE konjuge antikoru ve Fluo-4'de inkübe edilen dilimler, CTU'daki lokal bağışıklık hücrelerini etiketledi. Hücre içi kalsiyum seviyelerini gösteren psödocolor ölçekli görüntüler, hücre içi kalsiyumun diferansiyel seviyelerinin görselleştirilmesine izin verdi.
Vurgulanan CD11b pozitif immün hücre içindeki hücreler arası kalsiyum yanıtı öncesinde, sırasında ve sonrasında izlenen spontan aktivite ve zaman aşımı burada gösterilmiştir. CD11b immün hücresindeki kalsiyum yanıtlarının ham izleri, diğer duyarlı ve yanıt vermeyen hücrelerle birlikte ölçüldü. Burada psödomiksoma peritonei ile bir hasta tümör örneğinin immünotiplemesinin temsili sonuçları gösterilmiştir.
Tümör immün profilinin nicelleştirilmesi, donör numune 337'nin yüksek düzeyde M2 makrofajlarına sahip olduğunu gösterdi, bu da psödomiksoma peritonei türevi doku dilimlerinin kullanılmasının, hasta tümör örneklerinin benzersiz donör hücresel manzarasının sorgulanmasına izin verdiğini gösterdi. Psödomiksoma peritonei insan dokularından alınan doku dilimlerinin farmakotiplemesi ve aşağı akış analizi, sitotoksisite analizi ve tünel konfokal görüntüleme ile doğrulandığı gibi tümör dilimlerindeki hücrelerin öldürüldüğünü göstermiştir. Sitotoksik ilaca yanıt olarak, bortezomib ve 5-florourasil.
Işıldayan canlılık analizi, sıralı olarak eşleştirilen dilimler kullanılarak gerçekleştirildi. Müsinöz tümörlerden başarılı dilim üretimi, titiz bir diseksiyon ve yağ ve yoğun karın duvarı dokusu gibi hücresel ve asellüler doku bileşenlerinin çıkarılmasını gerektirir. Bu teknik, kanser hücreleri ile tümör mikro ortamındaki adipoz, vasküler ve bağışıklık hücresi etkileşimleri gibi çoklu hücre tipleri arasındaki etkileşimlerin modellenmesine izin verebilir.
