Bu yöntem, tümör dilimi eksperlerinde ilaç yanıt çalışmalarının tanısal amaçlara hizmet edebileceği klinik öncesi araştırmalarda anahtar soruların yanıtlatına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, dilim eksbitkilerinin kısa bir süre için mekansal olarak dağılmış fonksiyonlar da dahil olmak üzere yerli dokuların karmaşık biyolojisini modelleyebiliyor olmasıdır. Bu yöntem, rürin akciğer tümörlerinden alınan dilimlerin kullanımına ışık tokus edebilse de, insan dokuları da dahil olmak üzere diğer doku tiplerine de uygulanabilir.
Başlamak için vibratome hazırlayın ve kılavuzda belirtilen talimatlara göre bir VibraCheck gerçekleştirin. Daha sonra 24 kuyulu plakanın her kuyuyu penisilin ve streptomisin ile desteklenen hank'in dengeli tuz çözeltisinin bir mililitresi ile doldurun ve plakayı buzda tutun. Göğsün açığa çıkıp hayvanın gerilmesini sağlayacak şekilde strafor kapağına yerleştirilen ötenazili farenin dört patisine de 25 kalibrelik iğneler yerleştirin.
Sprey açıkta kalan cilt yüzeyine% 70 alkol. Karından göğsüne ve boyun bölgesine kadar açık deri kesmek için açılı bir pozisyonda yerleştirilen makas kullanın. Forceps kullanarak her iki tarafta cilt germek ve 25-gauge iğneler ekleyin.
Karın bölgesini kesin. Sonra akciğer ve kalp ortaya çıkarmak için göğüs kafesi ve diyafram açık kesin. Çevre doku keserek nefes borusu ortaya çıkar.
Akciğerleri inceleyin, kalple birlikte. Donmaya yerleştirilen Pen-Strep ile takviye buz gibi hbss 30 mililitre lik içeren 50 mililitrelik bir tüp içine dokuları yerleştirin ve mümkün olduğunca çabuk bir sonraki adıma geçin. Şimdi tümör taşıyan akciğerleri 10 santimetrelik doku kültür plakasına aktarın.
Akciğer loblarını ayırmak için steril makas ve forseps kullanın ve dilimlemek için yüzeyde tümörolan lobları seçin. Düz bir doku parçası yüzeyi oluşturmak için steril bir neşter kullanarak tümör çevreleyen normal akciğer veya ek tümör dokusunun bir kısmını kayma önlemek ve kesmek için filtre kağıt bir parça üzerinde bir tümör dokusu ile bir akciğer lob yerleştirin. Düz tarafı siyanoakrilat yapıştırıcıdamlabatırın ve vibratom numune tutucuya yerleştirin, böylece tümör bıçağı dik bir pozisyonda karşılar ve 2-3 dakika kurumasını bekleyin.
Vibratom numune tutucuyu metal tampon tepsisine yerleştirin. Doku tampona batırılınceye kadar tepsiyi Pen-Strep ile takviye edilmiş soğuk HBSS ile doldurun. Tampon tepsiyi, aletle birlikte verilen Pleksiglas kapakla kaplayın ve tepsiyi beyaz bir buz banyosuna yerleştirin ve dilimleme sırasında dokuyu serin tutmak için buz ekleyin.
Beyaz buz banyosunu vibratome takın. Sonra uygun dilimleme ayarlarını seçin ve dilimlemeye başlayın. Vibratome bıçağı dilimleme konumuna getirin ve dilimleme penceresini ayarlayın.
24 kuyulu bir tabakta dilimleri toplamak için steril çalgıları kullanın ve kalem-Strep ile birlikte bir mililitre hbss ile birlikte iyi ve buz üzerinde tutun. Dilimleme sırasını takip ederken, 24 kuyulu plakanın her kuyuyu deney planına göre işaretleyin. Sıfır saat veya kültürsüz referans olarak kültürlü dilimler bitişik bir doku dilimi toplayın.
Dokunun üst, orta ve alt temsil etmek için en az üç referans dilimleri toplayın. Dilimleme tamamlandıktan sonra sabitleme ve işlemeye devam edin. Bundan sonra, titanyum ızgaraları yerleştirerek kuyu başına kültür orta 2,5 mililitre içeren altı kuyulu bir plaka hazırlayın.
Titanyum ızgara ve orta arasında hiçbir hava kabarcıkları oluşan emin olun. Bir dilimi ızgaraya yüklemek için altı kuyulu plakayı açılı bir konumda tutun, böylece ortamın bir kısmı ızgarayı kaplayın. Daha sonra ızgara üzerinde orta dilim yerleştirin ve yaymak için forseps kullanın.
Dilimleri yerleştirdikten sonra, altı kuyulu plakaları 37 derece lik nemli bir kuluçka makinesinin içine yerleştirilen döner kuluçka ünitesine %95 02 ve %5 CO2 ile yükleyin. Döndürme döngüsünü başlatın. Uzun süreli ekim için doku dilimleri içeren ızgara kaldırmak ve altı kuyu plaka boş bir kuyuya yerleştirmek için steril forseps kullanarak her gün kültür ortamı doldurmak.
Ortamın %70'ini taze kültür ortamıyla değiştirin ve ızgarayı geri yerleştirin. Döndürme döngüsünü daha önce olduğu gibi devam edin. Tümör dilimleri üzerinde ilaç tedavisi için altı kuyu plaka içine seyreltilmiş ilaç veya araç kontrolü ile medya 2.5 mililitre ekleyin.
Titanyum ızgaraları kuyulara yerleştirin ve dilimleri daha önce olduğu gibi ızgaraların üzerine yerleştirin. Tedavileri 24 saat yaptıktan sonra sabitleme ve işleme ye devam edin. İstenilen dilimi sabitlemeye başlamak için, 2-3 mililitre PBS ile doldurulmuş ıslatılmış bir filtre kağıdı içeren 10 santimetrelik bir plakaya forceps kullanarak dikkatlice aktarın ve yüzdürün.
Daha sonra filtre kağıdını bir çift forsepsle çıkarın ve bir histo kasetine yerleştirin. Filtre kağıdını histo kasetine aktarın. Sonraki adımlar için dilimkonumunu işaretlemek için doku diliminin üstüne seyreltilmiş hematoksilin bir damla ekleyin.
Kaseti kapatın ve %4 nötr tamponlu formalin çözeltisine aktarın ve gece boyunca dört derece santigrat derecede bırakın. Protokolün açıklandığı şekilde kasetin yıkanması ve işlenmesinden sonra histo kasetini açın ve sabit dilimi filtre kağıdından dikkatlice kaldırmak için neşter kullanın. Filtre kağıdını atın ve dilimi sıvı parafin içeren bir kalıba aktarın.
Eşit bölümleme sağlamak için katıştırma kalıbının altına doku basmak için düz bir ağırlık kullanın. Histo kasetinin alt kısmını kalıbın üstüne yerleştirin. Üzerine sıvı parafin ekleyin.
Ve kalıp 30 dakika soğuk bir tabakta soğumasını bekleyin. Bundan sonra parafin bloğundan soğutulmuş kalıp ayırın. FFPE doku dilimi bloklarının dört mikrometre ince bölümlerini hazırlamak için bir mikrotom kullanın.
Dokuyu çevreleyen parafin fazlalığından kurtulun. Doku boyunca eşit bölümler elde etmek için bloğun açısını ayarlayın, böylece blok yüzeyinin bıçak ile ilgili olarak yatay olarak yönlendirilir. İnce bir fırça kullanarak cam slaytların üst kısmından başlayarak parafin gömülü doku diliminin sıralı doku bölümlerini toplayın.
Ortasına derin doku katmanları bölümleri toplamaya devam edin, cam slaytlar alt kısmı takip. Her doku diliminin farklı katmanlarından nesne slaytlarına bölümlerin toplanması, canlılık, hücre göçü veya biyomarker ifadesinde kültürkaynaklı degradelerin yakalanmasını sağlamak için yapılır. Bölümleri topladıktan sonra protokolde açıklandığı gibi işleme ve ileri analizile devam edilir.
Doku dilimi kalınlığı kültürlü dilimlerin canlılığını etkileyebilir. Bu durumda, 250 mikrometre kalınlığında dilimler, kalın dilimlerin dilimler boyunca oksijen veya besin difüzyonundaki eksikliklere yatkın hale gelmesi nedeniyle 200 mikrometre kalınlığındaki dilimlere göre artmış nekroz degradelerini göstermektedir. Ancak, 160 mikrometrelik ince dilimler büyük nekrotik alanlar muhtemelen bu kırılgan ve kıvrılma eğilimindedir olarak dilimlerin konumlandırılması sırasında teknik işleme neden içerir.
NKX2-1 analizi, iyi diferansiye akciğer adenokarsinomu bir belirteç, ifade önemli ölçüde sıfır saat kültürsüz dilimleri ile karşılaştırıldığında kültürlü dilimler içinde değiştirilmiş olmadığını göstermektedir. NKX2-1 ekspresyonunun kantitatif analizi, ekstre işleminin adenokarsinom dokusunun farklılaşma durumunu gözle görülür şekilde etkilemediğini düşündürerek, ifadenin kültürlü ve kültürsüz dilimlerde önemli ölçüde değiştirilmediğini doğruladı. Tümör doku dilimleri hedefli ilaçların etkinliğini değerlendirmek için kullanılabilir olup olmadığını test etmek için, onlar DMSO veya bileşiklerin titrated miktarları ile tedavi edildi.
4EBP1 mTOR yolu fosforilasyon hedefleyen bir mikromolar daktolisib ile tedavi edildiğinde inhibe edildi. MAP kiziaz yolunu hedefleyen 0.5 mikromolar selumetinib ERK1/2 fosforilasyonunun inhibe edilmesinde etkili oldu. Bu videoyu izledikten sonra nasıl çalışmak ve eleştirel değerli tümör dokularından taze kesilmiş dilimleri analiz etmek için iyi bir anlayışa sahip olmalıdır.
Bizim eski postdoc, Katja Narhi, önemli ölçüde IMI Predect Konsorsiyumu Doku Dilimi Platformu meslektaşları ile işbirliği içinde bu yöntemin kurulmasına katkıda bulunmuştur.
