Organotipik doku kesitleri çeşitli dokulardan oluşturulmuştur. Korunmuş doku bütünlüğü ve yetiştirme tekniklerinin gelişmesi nedeniyle, karmaşık fizyolojik mekanizmaların modellenmesi için uygun olmuştur. Pankreas karsinomlarından elde edilen organotipik dilim kültürleri, tümörün çok hücreli mimarisini ve mikroçevresini ex vivo olarak yeniden hesaplar.
İlaç yanıt testi gibi çeşitli alt uygulamalar için kullanılabilirler. Tümörün cerrahi rezeksiyonundan hemen sonra kültürlenebilirler ve diğer primer kültür tekniklerinin çoğuna kıyasla ucuz ve daha az zaman alıcıdırlar. Prosedürü göstermek, Lübeck Üniversitesi'nden bir teknik asistan olan Olha Lapshyna olacak.
Başlamak için, sekiz gram agarozu 100 mililitre önceden ısıtılmış zil çözeltisinde çözerek 100 mililitre düşük erime noktalı %8 agaroz hazırlayın ve ihtiyaç duyulana kadar dört santigrat derecede saklayın. Tümör rezeksiyonu duyurulduktan sonra, agarozu bir mikrodalgada eritin. Agarozu önceden ısıtılmış bir su banyosuna yerleştirin ve hazırlıktan önce fizyolojik sıcaklıklara soğumasını bekleyin.
Vibratom tutucusuna bir tıraş bıçağı yerleştirin ve üreticinin talimatlarına göre otomatik bir açı ayarı yapın. Bir soğutma ünitesi veya ıslak buz kullanarak kesme odasının ceketini soğutun. Kesme haznesini yaklaşık 100 mililitre zil solüsyonu ile doldurun, ardından monte edilmiş tıraş bıçağını önceden soğutulmuş kesme solüsyonuna yerleştirin ve tıraş bıçağının soğumasını bekleyin.
Doku örneğini soğutulmuş PBS ile yıkayın ve buz üzerinde 14 santimetrelik büyük bir Petri kabına yerleştirin. Bir neşter kullanarak buz üzerinde makroskopik olarak görünen fazla bağ dokusunu çıkarın. Dokuyu küçük bir Petri kabına yerleştirin.
Doku yönünü, kalan makroskopik olarak görünür bağ dokusu, Petri kabının tabanının düzlüğü ile aynı yöne sahip olacak şekilde ayarlayın. Hazırlanan düşük erime noktalı agarozu, dokunun yönünü yeniden ayarlayarak küçük Petri kabına dökün. Gerekirse, forseps kullanarak, agarozun daha hızlı sertleşmesi için Petri kabını ıslak buzun üzerine yerleştirin.
Dokuyu bir neşter kullanarak dikkatlice kesin ve dokunun her iki tarafında en az beş milimetre çevreleyen agaroz bırakın. Numune tutucuya yapıştırıcı ekleyin, yayın ve gömülü dokuyu aktarın ve süper yapıştırıcı kullanarak numune tutucuya yapıştırın. Birkaç saniye sonra, numune tutucuyu kesme haznesine yerleştirin ve gerekirse dokunun yönünü tıraş bıçağına doğru ayarlayın.
Doku örneğinin boyutuna göre kesme aralığının dış sınırlarını tanımlayın. Bıçağı doku bloğunun üst kısmına doğru ayarlayın. Kesme hızını saniyede 0,04 milimetreye, kesme genliğini bir milimetreye ve dilim kalınlığını 300 mikrometreye ayarlayın.
İlk dilimleri dikkatlice kesin ve dilimleri ıslak buz üzerinde önceden soğutulmuş zil çözeltisi ile ayrı bir kaba aktarın. Kuyu başına bir mililitre uygun yetiştirme ortamı içeren altı oyuklu bir plaka hazırlayın. Altı oyuklu plakayı ortamla birlikte bir inkübatöre yerleştirin ve ekimden önce sıcaklık ve pH'ın ayarlanmasına izin verin.
Dilimleri bir bakış filtresi kullanarak hücre kültürü eklerine yerleştirin, ardından yüklü filtreyi steril bir beze yerleştirerek fazla zil çözeltisini çıkarın. Yüklenen filtreyi, ek parçaya herhangi bir ek ortam eklemeden hazırlanan altı oyuklu plakaya yerleştirin, ardından altı oyuklu plakayı bir inkübatöre yerleştirin ve ortamı iki günde bir değiştirin. Yetiştirme filtresini monte edilmiş dilimle birlikte bir Petri kabına yerleştirin.
Bir neşter ile, filtre zarını monte edilmiş doku dilimi ile dikkatlice kesin. Filtre membranını monte edilmiş dilimle birlikte bir biyopsi naylon torbasına aktarın ve bir gömme kasetine yerleştirin. Daha sonra, plastik gömme kasetlerini en az 24 saat veya daha fazla kullanılana kadar önceden soğutulmuş% 4.5 formalin içeren bir kaba aktarın.
Formalin sabit dilim kültürünü 1.5 saat boyunca akan musluk suyu ile dikkatlice durulayın. Formalin sabit doku dilimini% 70% 95 ve mutlak etanol içinde inkübasyon ile dehidre edin. Daha sonra, formalin sabit doku dilimini ksilen içinde iki adet üç saatlik inkübasyon ile temizleyin.
Dokuyu parafin ile gece boyunca 60 santigrat dereceye daldırın ve ardından iki saat boyunca tekrar daldırın. Dokuyu bir parafin bloğuna, bir doku gömme kalıbına gömün ve numuneyi daha hızlı soğutmak için buzun üzerine yerleştirin. Parafine gömülü doku bloğunu dört mikrometre kalınlığında bir Mikrotom ile ve damıtılmış su içeren 40 derecelik bir su banyosunda bölümlere ayırın.
Bölümleri cam slaytlara aktarın. Dokuyu cama bağlamak için parafin bölümlerini 60 santigrat derecede bir saat inkübe edin. Ardından, slaytları gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.
Her biri beş dakika boyunca ksilen içinde üç kez inkübe ederek bölümleri deparafinize edin. Daha sonra, mutlak alkol,% 95 alkol ve% 70 alkol içinde ardışık inkübasyonlarla rehidre edin. Bölümleri Mayer Hematoksilen solüsyonunda beş dakika boyayın ve 10 dakika boyunca akan musluk suyu ile durulayın.
% 0.5 ESN çözeltisinde 40 saniye boyunca lekeleyin ve damıtılmış su ile durulayın, ardından dehidrasyonu etanolde tekrarlayın. Dokuyu her biri birkaç saniye boyunca üç ksilen değişikliğinde temizleyin, ardından bir damla montaj ortamı yerleştirin ve slaytları bir kapak kayması. Her OTSC'nin makroskopik morfolojisi, altı gün boyunca ekim sırasında azaldı.
İki farklı besiyerinde iki temsili primer tümörden OTSC'ler için canlılık korunmuştur, kesit alma prosedürü ve kültür koşullarına uyum nedeniyle sıfırıncı günden sonra canlılıkta bir azalma ve ayrıca sağ paneldeki tümör örneğinin canlılığında bir artış göstermiştir. H&E boyama bölümleri, dokunun genel yapısının ex vivo olarak tüm ekim süresi boyunca korunduğunu ve altı günlük kültür periyodu boyunca proliferasyon ve apoptozda herhangi bir büyük değişiklik tespit edilmediğini gösterdi. H&E kesitlerinin mikroskobik histopatolojik değerlendirmesi, kültivasyon sırasında tüm ekili dokuların nekrozunda önemli bir artış göstermedi.
15 gün boyunca primer pankreas duktal adenokarsinomu veya PDAC yetiştirildikten sonra parçalanmış Kaspaz-3 pozitif hücrelerde bir artış oldu. Bir PDAC'ın peritoneal metastazının histopatolojisi, tek tek dilimler arasında yüksek bir intratümöral heterojenite ve ayrıca bölünmüş Kaspaz-3 boyaması ile ölçülen doğal olarak oluşan apoptoz gösterdi. Karın duvarının bir PDAC metastazında Sitokeratin 7 için H&E boyaması ve immünohistolojik karakterizasyon, türetilmiş OTSC'lerin herhangi bir tümör hücresi içermediğini, sadece kısmen nekrotik olan bağ dokusundan oluştuğunu gösterdi.
Kültürlenmiş her dilim, spesifik araştırma sorusuna bağlı olarak, örneğin transkriptomik için RNA dizilimi veya uzamsal olarak çözülmüş proteomik için hafif görüntüleme ile ayrı ayrı profillenebilir. Gelecekte, tahribatsız analitik yöntemlerle kombinasyon, farklı terapötik rejimlere hastaya özgü yanıtları tahmin etmek için büyük bir potansiyele sahiptir.
