기니피그 눈에서 망막 색소 상피 세포의 분리

망막 색소 상피 또는 RPE는 망막 건강에 매우 중요합니다. 그리고 분리된 RPE를 연구하는 것은 망막 질환에 매우 중요합니다. 인기 있는 근시 모델인 기니피그에서 RPE를 분리하는 이 방법은 어려운 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.

이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 RPE 분석을 포함한 생물학적 분자 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다. 시연 된 기술을 완벽하게 따르고 해부 도구를 조작하는 방법을 관찰함으로써 약간의 연습으로이 절차를 빠르게 마스터 할 수 있습니다. 기니피그를 인도적으로 안락사시키고 동물의 눈을 적출 한 후 즉시 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어있는 10cm 페트리 접시에 옮겨 눈을 씻으십시오.

세척 후 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 해부 현미경으로 작업하면서 18 게이지 바늘을 사용하여 각막과 공막 사이의 윤부 경계에서 약 1mm 뒤에있는 한쪽 눈의 공막에 초기 작은 구멍을 만듭니다. 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 앞쪽 부분을 제거합니다.

그런 다음 나머지 후방 안구 분절로 작업하여 집게를 사용하여 Zinn의 구역을 잡고 부드럽게 잡아당긴 다음 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리하고 단편화 없이 망막을 벗겨냅니다. 망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 2밀리리터의 조직 저장 시약이 들어 있는 12웰 플레이트의 웰 중 하나에 담그고 5분 동안 담그십시오. 보관 시약을 헹구기 위해 아이컵을 4밀리리터의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2밀리리터의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.

최종 RPE 격리 단계를 진행하기 전에 PBS로 채워진 1밀리리터 주사기를 준비하고 30게이지 바늘을 부착합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 현미경으로 작업하면서 먼저 이 PBS 스트림을 RPE로 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만듭니다.

그런 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 유도하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다. 맥락막에서 RPE를 분리한 후 바늘이 없는 1밀리리터 주사기에 RPE 세포를 수집하고 수집된 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수집된 RPE를 8, 000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다.

RNA 분석에 사용할 샘플의 경우 상층액, 즉 PBS 용액을 버리고 RNA 분리 키트에 포함된 350ml의 용해 완충액으로 교체합니다. 내용물을 위아래로 20회 피펫하여 잘 섞이고 샘플의 품질을 보존합니다. 장기 보관 및 보존을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고로 옮깁니다.

전기영동을 통해 시료의 품질을 평가하기 전에 RNA 분리 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 RPE 시료에서 RNA를 분리하고 수집합니다. 본 연구에서, 수집된 RPE 샘플은 RNA 완전성 수 또는 RIN이 8보다 큰 잘 보존된 RNA를 보여주었다. 눈당 약 240나노그램의 총 RNA 수.

RPE 특이적 유전자인 Rpe65의 발현 수준은 맥락막 및 공막에서보다 RPE 샘플에서 유의하게 더 높은 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, RPE 샘플은 선별된 맥락막 공막 특이적 유전자인 콜라겐 유형 알파-온의 최소 발현을 보여주었으며, 이는 분리된 RPE 샘플에서 맥락막 및 공막 오염 물질이 없음을 나타냅니다. 절차의 가장 중요한 단계는 망막 조각을 남기지 않고 망막을 부드럽게 제거하는 것입니다.

이 RPE 분리 절차는 분리 후 RPE 세포를 담그기 위한 배지 선택을 포함하여 몇 가지 중요한 차이점이 있는 시험관 내 세포 배양 연구에 대한 설명을 보증합니다.