망막 색소 상피 또는 RPE는 망막 건강에 매우 중요합니다. 그리고 분리된 RPE를 연구하는 것은 망막 질환에 매우 중요합니다. 인기 있는 근시 모델인 기니피그에서 RPE를 분리하는 이 방법은 어려운 문제를 해결하는 데 도움이 됩니다.
이 기술의 주요 장점은 비교적 간단하고 RPE 분석을 포함한 생물학적 분자 연구에 적합한 고품질 RPE 샘플을 얻을 수 있다는 것입니다. 시연 된 기술을 완벽하게 따르고 해부 도구를 조작하는 방법을 관찰함으로써 약간의 연습으로이 절차를 빠르게 마스터 할 수 있습니다. 기니피그를 인도적으로 안락사시키고 동물의 눈을 적출 한 후 즉시 멸균 인산염 완충 식염수 또는 PBS가 들어있는 10cm 페트리 접시에 옮겨 눈을 씻으십시오.
세척 후 눈을 신선한 PBS 용액으로 옮깁니다. 이제 해부 현미경으로 작업하면서 18 게이지 바늘을 사용하여 각막과 공막 사이의 윤부 경계에서 약 1mm 뒤에있는 한쪽 눈의 공막에 초기 작은 구멍을 만듭니다. 가위를 사용하여 각막, 홍채, 모양체 및 수정체를 포함한 앞쪽 부분을 제거합니다.
그런 다음 나머지 후방 안구 분절로 작업하여 집게를 사용하여 Zinn의 구역을 잡고 부드럽게 잡아당긴 다음 RPE/맥락막/공막 복합체에서 망막을 분리하고 단편화 없이 망막을 벗겨냅니다. 망막이 완전히 제거된 후 RPE, 맥락막 및 공막을 포함하는 나머지 후방 안구 컵을 2밀리리터의 조직 저장 시약이 들어 있는 12웰 플레이트의 웰 중 하나에 담그고 5분 동안 담그십시오. 보관 시약을 헹구기 위해 아이컵을 4밀리리터의 PBS로 채워진 다른 웰로 10초 동안 옮긴 후 2밀리리터의 PBS로 채워진 세 번째 웰로 옮깁니다.
최종 RPE 격리 단계를 진행하기 전에 PBS로 채워진 1밀리리터 주사기를 준비하고 30게이지 바늘을 부착합니다. 주사기 플런저를 부드럽게 눌러 PBS의 제트 기류를 만듭니다. 현미경으로 작업하면서 먼저 이 PBS 스트림을 RPE로 조준하여 작은 찢어짐이나 구멍을 만듭니다.
그런 다음 PBS 스트림을 생성된 개구부로 유도하여 맥락막에서 시트로 RPE를 분리합니다. 맥락막에서 RPE를 분리한 후 바늘이 없는 1밀리리터 주사기에 RPE 세포를 수집하고 수집된 샘플을 1.5밀리리터 튜브로 옮깁니다. 수집된 RPE를 8, 000 x g에서 1분 동안 원심분리하여 RPE 펠릿을 얻었다.
RNA 분석에 사용할 샘플의 경우 상층액, 즉 PBS 용액을 버리고 RNA 분리 키트에 포함된 350ml의 용해 완충액으로 교체합니다. 내용물을 위아래로 20회 피펫하여 잘 섞이고 샘플의 품질을 보존합니다. 장기 보관 및 보존을 위해 샘플을 섭씨 영하 80도의 냉동고로 옮깁니다.
전기영동을 통해 시료의 품질을 평가하기 전에 RNA 분리 키트를 사용하고 제조업체의 지침에 따라 RPE 시료에서 RNA를 분리하고 수집합니다. 본 연구에서, 수집된 RPE 샘플은 RNA 완전성 수 또는 RIN이 8보다 큰 잘 보존된 RNA를 보여주었다. 눈당 약 240나노그램의 총 RNA 수.
RPE 특이적 유전자인 Rpe65의 발현 수준은 맥락막 및 공막에서보다 RPE 샘플에서 유의하게 더 높은 것으로 밝혀졌습니다. 대조적으로, RPE 샘플은 선별된 맥락막 공막 특이적 유전자인 콜라겐 유형 알파-온의 최소 발현을 보여주었으며, 이는 분리된 RPE 샘플에서 맥락막 및 공막 오염 물질이 없음을 나타냅니다. 절차의 가장 중요한 단계는 망막 조각을 남기지 않고 망막을 부드럽게 제거하는 것입니다.
이 RPE 분리 절차는 분리 후 RPE 세포를 담그기 위한 배지 선택을 포함하여 몇 가지 중요한 차이점이 있는 시험관 내 세포 배양 연구에 대한 설명을 보증합니다.
