Bu protokol, yükleme sırasında bir tendon içindeki lokal doku suşlarının ölçülmesini sağlar. Tendonların mekanik olarak nasıl davrandıklarını ve yükleme ortamlarına nasıl uyum sağladıklarını anlamak yararlıdır. Bu tekniğin temel avantajı, kullanılan yazılımın çevrimiçi olarak halka açık olması ve gerçek doku suşları bilinmediğinde bile ölçüm doğruluğu hakkında geri bildirim sağlamasıdır.
Bir tendondaki lokal doku suşlarının ölçülmesi, hücrelerin tendon dejenerasyonu ve onarımı sırasında dokuyu nasıl yeniden şekillendirdiğini anlamak için değerlidir. Bu prosedürü gösteren, bir lisans öğrencisi olan Stanton Godshall ve laboratuvarımda doktora öğrencisi olan Krishna Pedaprolu olacak. Hasat edilen Aşil tendonlarını DTAF'ta boyadıktan sonra, dokuyu DTAF çözeltisinden DRAQ5 çözeltisine aktarın ve dokuları oda sıcaklığında 10 dakika boyunca karanlık bir alanda inkübe edin.
Tendonu çekme yükleme cihazının çenelerine yerleştirin. Çeneleri yükleme cihazına monte etmeden önce, kalkaneus bağlantısı ile ters kavrama arasındaki mesafeyi ölçmek için dijital kaliperler kullanın. Doku hidrasyonunu korumak için çeneleri PBS içeren yükleme cihazına monte edin.
Tendonu mikroskop görüntülerinin x ekseni veya y ekseni ile mümkün olduğunca iyi hizalayın, böylece algoritmanın X gerinim ve Y gerinim çıktıları tendon eksenine karşılık gelir. Tendonu bir gram gerginlikle önceden yükleyin. İstenirse, dokunun orta bölgesinde 80 mikron aralıklı dört çizgiden oluşan bir dizi fotobleach yapın ve işlemi çenelerin yakınındaki sol ve sağ uçlarda tekrarlayın.
Her doku bölgesindeki çizgiler arasındaki mesafe değişikliği, verileri doğrulamak için kullanılabilecek yerel doku suşlarının ikincil bir ölçümüdür. Daha sonra, konfokal mikroskobu kullanarak, DTAF ve DRAQ5 floresansının hacimsel görüntülerini bir gram ön yükte elde edin. Saniyede% 0,5'te% 2 gerinime bir gerinim rampası gerçekleştirin.
Gerinim hızının ve artımlı gerinim büyüklüğünün ayarlanabileceğini unutmayın. Dokunun strese girmesine izin verdikten sonra 10 dakika boyunca rahatlayın, deformasyondan sonra dokunun başka bir hacimsel görüntüsünü alın. İşlemi istediğiniz kadar gerinim artışı için tekrarlayın.
Dijital olarak dönüştürülmüş görüntüleri oluşturmak için digital_strain kodunu indirin. GitHub'dan m. İndirdikten sonra kodu açın ve çalıştırın.
İstendiğinde, Tamam düğmesine basmadan önce uygulanan maksimum gerinim, uygulanan gerinim artışı ve Poisson oranı için istenen değerleri girin. Ardından yeniden istendiğinde, deforme olmamış referans görüntüsünü seçin. Her gerinim artışı için, referans görüntünün ve dönüştürülen görüntünün bir bindirmesi görüntülenir. Dijital olarak dönüştürülen görüntüler, X'in gerinim artışı olduğu dijital olarak dönüştürülmüş yüzde X gerinimi adlı dizine kaydedilir.
Görüntülenen adla komut dosyasını açın ve görüntü analizine başlamak için Çalıştır'ı tıklatın. İstendiğinde, artırılmış Lagrangian dijital görüntü korelasyonu veya ALDIC parametrelerinin değerlerini istediğiniz gibi değiştirin. İstendikten sonra, istenen değişken koleksiyonu için ortalama değeri, standart sapmayı ve 2B haritayı otomatik olarak kaydetmek üzere evet onay kutusunu seçin.
İstendiğinde, X gerinimi, Y gerinimi, kesme gerinimi, kötü bölgeler vb. gibi istediğiniz değişkenleri seçin ve Tamam'a basın. Bir sonraki istemi takiben, yeniden adlandırılan maksimum yoğunluklu Z projeksiyonlarını içeren klasörü seçin. Yazılım, deforme olmuş görüntülerin gerinim alanlarını belirlemek için otomatik olarak artımlı ALDIC gerçekleştirir. İstendiğinde, suşları ölçmek için ilgi alanını tanımlamak üzere dört noktalı bir çokgen oluşturmak için sol tıklayın.
555 ve 556 satırları ayarlanarak yeniden adlandırılabilen nükleer izleme sonuçları klasörü, daha önce belirtilen tüm grafikleri saklar. Bu klasör ayrıca, daha önce belirtilen tüm araçları ve standart sapmaları depolayan sonuçlar adlı bir elektronik tablo da içerir. Dijital olarak gerilmiş görüntüler kullanılarak doğrulandığında, ALDIC algoritması sürekli olarak ortalama X gerinimini hafife aldı ve uygulanan gerinimin artmasıyla hata büyüklüğü arttı.
Y suşu da çoğunlukla hafife alındı. Bununla birlikte, her durumda, gerinim hatasının büyüklüğü çok küçüktü. Hesaplanan X gerinimi ve Y suşunun standart sapması, büyüklüğü düşük olmasına rağmen, uygulanan gerinimin artmasıyla artmıştır.
Kötü bölge analizi, kümülatif yöntem kullanılarak analiz edilen dijital olarak dönüştürülmüş görüntülerde geçersiz gerinim hesaplamalarına sahip kötü bölgelerin sayısının% 6 uygulanan gerinimden sonra tutarlı bir şekilde arttığını, artımlı miktarın ise% 1'de kaldığını ortaya koymuştur. aykırı değer olarak kabul edilen dört örneklemden birinde, görüntünün neredeyse yarısı maksimum gerinim artışında kötü olarak tanımlanmıştır. ALDIC tarafından hesaplanan X suşları, PBL'lerden belirlenenlerden daha büyüktü, fark, tüm örneklerde PBL verilerinin ortalaması için standart sapmaya benzeyen 0.005 arasındaydı. Çekme yükü altındaki tendonlardaki yerel suşların büyüklüklerinin ve uzamsal dağılımlarının belirlenmesi, tüm örneklerde, X suşunun sürekli olarak uygulanan suşların altında kaldığını göstermiştir.
Y yönündeki ortalama gerinim, tüm artışlar için yaklaşık sıfırdı, ancak standart sapma yüksekti. Ortalama kesme gerinimi, gerinim artışları boyunca istikrarlı bir şekilde artmıştır. Hatırlanması gereken en önemli nokta, daha büyük bir gerilme uygulamadan önce görüntüleri kaydetmektir.
Görüntüler, kaydedilmezse, kaybolur ve kurtarılamaz. Bu teknik, tendonlardaki doku suşlarını ölçmek için özel olarak doğrulanmış olsa da, mekanik biyoloji ve diğer birçok hayvan ve insan dokusunun mekaniği hakkında fikir verebilir.
