该协议能够在加载期间测量肌腱内的局部组织应变。了解肌腱的机械行为并适应其负载环境很有用。该技术的主要优点是所使用的软件可以在线公开获得，即使真正的组织菌株未知，也能提供有关测量精度的反馈。
测量肌腱中的局部组织应变对于了解细胞在肌腱变性和修复过程中如何重塑组织很有价值。演示这一程序的将是本科生Stanton Godshall和我实验室的博士生Krishna Pedaprolu。在DTAF中染色收获的跟腱后，将组织从DTAF溶液转移到DRAQ5溶液中，并在室温下在黑暗空间中孵育组织10分钟。
将肌腱放入拉伸加载装置的夹具中。在将夹具安装到装载装置中之前，请使用数字卡尺测量跟骨附件与另一侧夹具之间的距离。将夹具安装到含有PBS的装载装置中，以保持组织水合作用。
将肌腱尽可能与显微镜图像的 x 轴或 y 轴对齐，以便算法的 X 应变和 Y 应变输出与肌腱轴相对应。用一克张力预加载肌腱。如果需要，在组织的中心区域对一组间隔80微米的四条线进行光漂白，并在夹具附近的左右极端重复该过程。
每个组织区域中线之间的距离变化是可用于验证数据的局部组织菌株的二次测量。接下来，使用共聚焦显微镜，在一克预载荷下获取DTAF和DRAQ5荧光的体积图像。以每秒0.5%的速度将应变斜坡上升至2%应变。
请注意，可以调整应变率和增量应变大小。让组织应力放松10分钟后，在变形后拍摄组织的另一张体积图像。根据需要对任意数量的应变增量重复该过程。
要创建经过数字转换的图像，请下载代码digital_strain。m来自GitHub。下载后，打开并运行代码。
出现提示时，在按 OK 之前插入最大施加应变、施加应变增量和泊松比的所需值。然后，当再次出现提示时，选择未变形的参考图像。对于每个应变增量，将显示参考图像和转换后的图像的叠加。经过数字转换的图像将保存到名为“数字转换的X%应变”的目录中，其中X是应变增量。
打开具有显示名称的脚本，然后单击运行以开始图像分析。出现提示时，根据需要更改增强拉格朗日数字图像相关或 ALDIC 参数的值。出现提示后，选中 yes 复选框以自动保存所需变量集合的平均值、标准差和 2D 图。
出现提示时，选择所需的变量，如 X 应变、Y 应变、剪切应变、坏区域等，然后按 OK。按照下一个提示，选择包含重命名的最大强度 Z 投影的文件夹。软件自动执行增量ALDIC以确定变形图像的应变场。出现提示时，左键单击以创建一个四点面，以定义用于测量应变的感兴趣区域。
文件夹核跟踪结果（可通过调整行 555 和 556 重命名）存储先前指定的所有图。此文件夹还包含一个名为结果的电子表格，该电子表格存储之前指定的所有均值和标准差。当使用数字应变图像进行验证时，ALDIC算法始终低估了平均X应变，并且误差幅度随着施加应变的增加而增加。
Y菌株也大多被低估了。然而，在所有情况下，应变误差的大小都非常小。计算出的X应变和Y应变的标准差虽然幅度较低，但随着施加应变的增加而增加。
坏区分析显示，使用累积法分析的数字化转换图像中具有无效应变计算的坏区数量在施加6%应变后持续增加，而增量数量保持在1%在四个样本中的一个中，被视为异常值，近一半的图像在最大应变增量下被识别为坏图像。ALDIC计算的X菌株大于PBL测定的X菌株，差异在0.005以内，与所有样本中平均的PBL数据的标准差相似。确定拉伸载荷下肌腱局部应变的大小和空间分布表明，在所有样品中，X应变始终保持在施加的应变以下。
对于所有增量，Y方向上的平均应变近似为零，但标准偏差很高。平均剪切应变在整个应变增量过程中稳步增加。要记住的最重要的一点是在施加更大的应变之前保存图像。
如果未保存，图像将丢失且无法恢复。虽然该技术专门用于测量肌腱内的组织应变，但它可以提供对许多其他动物和人体组织的机械生物学和力学的见解。
