Этот протокол позволяет измерять локальные деформации тканей в сухожилии во время нагрузки. Полезно понять, как сухожилия ведут себя механически и приспосабливаются к условиям нагрузки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что используемое программное обеспечение находится в открытом доступе в Интернете и обеспечивает обратную связь о точности измерений, даже если истинные деформации тканей неизвестны.
Измерение локальных деформаций тканей в сухожилии полезно для понимания того, как клетки реконструируют ткань во время дегенерации и восстановления сухожилий. Эту процедуру продемонстрируют Стэнтон Годшалл, студент бакалавриата, и Кришна Педапролу, аспирант моей лаборатории. После окрашивания собранных ахилловых сухожилий в DTAF перенесите ткань из раствора DTAF в раствор DRAQ5 и инкубируйте ткани в темном помещении в течение 10 минут при комнатной температуре.
Поместите сухожилие в захваты растягивающего нагрузочного устройства. Перед установкой захватов в загрузочное устройство с помощью цифровых штангенциркулей измерьте расстояние между насадкой пяточной кости и противоположной рукояткой. Установите рукоятки в загрузочное устройство, содержащее PBS, чтобы поддерживать увлажнение тканей.
Выровняйте сухожилие как можно лучше по оси X или Y изображений микроскопа так, чтобы выходные данные алгоритма по деформации X и деформации Y соответствовали оси сухожилия. Предварительно напрягите сухожилие одним граммом напряжения. При желании отбельте набор из четырех линий, расположенных на расстоянии 80 микрон друг от друга в центральной области ткани, и повторите процесс на левом и правом крайних концах возле захватов.
Изменение расстояния между линиями в каждой области ткани является вторичным измерением местных тканевых штаммов, которое может быть использовано для проверки данных. Затем с помощью конфокального микроскопа получают объемные изображения флуоресценции DTAF и DRAQ5 при одном грамме предварительной нагрузки. Выполните увеличение деформации до 2% со скоростью 0,5% в секунду.
Обратите внимание, что скорость деформации и величина дополнительной деформации можно регулировать. Позволив ткани расслабиться в течение 10 минут, сделайте еще одно объемное изображение ткани после деформации. Повторите процесс для любого желаемого количества приращений деформации.
Чтобы создать изображения с цифровым преобразованием, загрузите код digital_strain. m с GitHub. После загрузки откройте и запустите код.
При появлении запроса введите желаемые значения для максимальной приложенной деформации, приращения приложенной деформации и коэффициента Пуассона, прежде чем нажимать OK. Затем, когда снова будет предложено, выберите недеформированный эталонный образ. Для каждого приращения деформации отображается наложение эталонного изображения и преобразованного изображения. Изображения, преобразованные в цифровом виде, будут сохранены в каталоге с именем X процентов деформации с цифровым преобразованием, где X — это приращение деформации.
Откройте скрипт с отображаемым именем и нажмите «Выполнить», чтобы начать анализ изображения. При появлении запроса измените значения дополненной корреляции цифровых изображений Лагранжа или параметров ALDIC по своему усмотрению. После появления запроса установите флажок «Да», чтобы автоматически сохранить среднее значение, стандартное отклонение и 2D-карту для нужного набора переменных.
При появлении запроса выберите нужные переменные, такие как деформация X, деформация Y, деформация сдвига, поврежденные области и т. д., и нажмите OK. Следуя следующему запросу, выберите папку, содержащую переименованные проекции максимальной интенсивности Z. Программное обеспечение автоматически выполняет инкрементальный ALDIC для определения полей деформации деформированных изображений. При появлении запроса щелкните левой кнопкой мыши, чтобы создать четырехточечный многоугольник, чтобы определить область, представляющую интерес для измерения деформаций.
В папке «Результаты ядерного слежения», которую можно переименовать, скорректировав строки 555 и 556, хранятся все графики, указанные ранее. Эта папка также содержит электронную таблицу с именем results, в которой хранятся все средние значения и стандартные отклонения, указанные ранее. При проверке с использованием цифровых напряженных изображений алгоритм ALDIC постоянно недооценивал среднюю деформацию X, и величина ошибки увеличивалась с увеличением приложенной деформации.
Штамм Y также был в основном недооценен. Однако во всех случаях величина погрешности деформации была очень малой. Стандартное отклонение расчетных деформаций X и Y, хотя и невелико, увеличивалось с увеличением приложенной деформации.
Анализ плохих областей показал, что количество плохих областей с недопустимыми расчетами деформации в изображениях с цифровым преобразованием, проанализированных с использованием кумулятивного метода, постоянно увеличивалось после 6%-ной деформации, в то время как добавочное количество оставалось на уровне 1%В одном из четырех образцов, который рассматривался как выброс, почти половина изображения была идентифицирована как плохая при максимальном приращении деформации. Штаммы X, рассчитанные с помощью ALDIC, были больше, чем те, которые были определены по PBL, разница была в пределах 0,005, что аналогично стандартному отклонению для данных PBL, усредненному по всем образцам. Определение величин и пространственного распределения локальных деформаций в сухожилиях под растягивающей нагрузкой показало, что во всех образцах деформация X последовательно оставалась ниже применяемых деформаций.
Средняя деформация в направлении Y была приблизительно равна нулю для всех приращений, но стандартное отклонение было высоким. Средняя деформация сдвига неуклонно увеличивалась на протяжении всего приращения деформации. Самый важный момент, который следует помнить, - это сохранить изображения перед применением большей нагрузки.
Изображения, если они не сохранены, теряются и не могут быть восстановлены. Хотя этот метод специально проверен для измерения деформаций тканей в сухожилиях, он может дать представление о механической биологии и механике многих других тканей животных и человека.
