Questo protocollo consente la misurazione delle tensioni tissutali locali all'interno di un tendine durante il carico. È utile capire come i tendini si comportano meccanicamente e si adattano al loro ambiente di carico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il software utilizzato è pubblicamente disponibile online e fornisce un feedback sull'accuratezza della misurazione anche quando i veri ceppi tissutali sono sconosciuti.
Misurare le tensioni tissutali locali in un tendine è prezioso per capire come le cellule rimodellano il tessuto durante la degenerazione e la riparazione del tendine. A dimostrare questa procedura saranno Stanton Godshall, uno studente universitario, e Krishna Pedaprolu, uno studente di dottorato nel mio laboratorio. Dopo aver colorato i tendini di Achille raccolti in DTAF, trasferire il tessuto dalla soluzione DTAF alla soluzione DRAQ5 e incubare i tessuti in uno spazio buio per 10 minuti a temperatura ambiente.
Posizionare il tendine nelle impugnature del dispositivo di carico della trazione. Prima di montare le impugnature nel dispositivo di caricamento, utilizzare calibri digitali per misurare la distanza tra l'attacco del calcagno e l'impugnatura opposta. Montare le impugnature nel dispositivo di caricamento contenente PBS per mantenere l'idratazione dei tessuti.
Allineare il tendine nel miglior modo possibile con l'asse x o y delle immagini del microscopio in modo che le uscite della deformazione X e della deformazione Y dell'algoritmo corrispondano all'asse del tendine. Precaricare il tendine con un grammo di tensione. Se lo si desidera, fotocandeggina una serie di quattro linee distanziate di 80 micron nella regione centrale del tessuto e ripetere il processo sugli estremi sinistro e destro vicino alle impugnature.
La variazione della distanza tra le linee in ciascuna regione tissutale è una misura secondaria dei ceppi tissutali locali che può essere utilizzata per convalidare i dati. Successivamente, utilizzando il microscopio confocale, acquisire immagini volumetriche della fluorescenza DTAF e DRAQ5 a un grammo di precarico. Eseguire una rampa di deformazione al 2% di deformazione allo 0,5% al secondo.
Si noti che la velocità di deformazione e l'entità della deformazione incrementale possono essere regolate. Dopo aver permesso al tessuto di rilassarsi per 10 minuti, prendere un'altra immagine volumetrica del tessuto dopo la deformazione. Ripetere il processo per tutti gli incrementi di deformazione desiderati.
Per creare le immagini trasformate digitalmente, scarica il codice digital_strain. m da GitHub. Dopo il download, apri ed esegui il codice.
Quando richiesto, inserire i valori desiderati per la deformazione massima applicata, l'incremento della deformazione applicata e il rapporto di Poisson prima di premere OK. Quindi, quando richiesto, selezionate l'immagine di riferimento non deformata. Per ogni incremento di deformazione, viene visualizzata una sovrapposizione dell'immagine di riferimento e dell'immagine trasformata. Le immagini trasformate digitalmente verranno salvate nella directory denominata deformazione X percentuale trasformata digitalmente dove X è l'incremento di deformazione.
Aprire lo script con il nome visualizzato e fare clic su Esegui per iniziare l'analisi dell'immagine. Quando richiesto, modificare i valori per la correlazione dell'immagine digitale lagrangiana aumentata o i parametri ALDIC come desiderato. Dopo essere stato richiesto, selezionare la casella di controllo Sì per salvare automaticamente il valore medio, la deviazione standard e la mappa 2D per la raccolta desiderata di variabili.
Quando richiesto, selezionare le variabili desiderate come ceppo X, ceppo Y, ceppo di taglio, regioni danneggiate, eccetera e premere OK. Dopo il prompt successivo, selezionare la cartella che contiene le proiezioni Z di intensità massima rinominate. Il software esegue automaticamente ALDIC incrementali per determinare i campi di deformazione delle immagini deformate. Quando richiesto, fare clic con il pulsante sinistro del mouse per creare un poligono a quattro punti per definire la regione di interesse per la misurazione delle deformazioni.
La cartella risultati del tracciamento nucleare, che può essere rinominata regolando le righe 555 e 556, memorizza tutti i grafici specificati in precedenza. Questa cartella contiene anche un foglio di calcolo denominato risultati, che memorizza tutte le medie e le deviazioni standard specificate in precedenza. Quando convalidato utilizzando immagini tese digitalmente, l'algoritmo ALDIC ha costantemente sottostimato la deformazione X media e l'entità dell'errore è aumentata con l'aumentare della tensione applicata.
Anche il ceppo Y è stato per lo più sottovalutato. Tuttavia, in tutti i casi, l'entità dell'errore di deformazione era molto piccola. La deviazione standard del ceppo X calcolato e del ceppo Y, sebbene di bassa entità, aumentava con l'aumentare della deformazione applicata.
L'analisi delle regioni danneggiate ha rivelato che il numero di regioni danneggiate con calcoli di deformazione non validi nelle immagini trasformate digitalmente analizzate utilizzando il metodo cumulativo è aumentato costantemente dopo il 6% di deformazione applicata, mentre la quantità incrementale è rimasta all'1% In uno dei quattro campioni, che è stato trattato come anomalo, quasi la metà dell'immagine è stata identificata come cattiva al massimo incremento di deformazione. I ceppi X calcolati da ALDIC erano più grandi di quelli determinati dai PBL, la differenza era compresa tra 0,005, che è simile alla deviazione standard per i dati PBL mediati in tutti i campioni. La determinazione delle grandezze e delle distribuzioni spaziali delle deformazioni locali nei tendini sotto carico di trazione ha mostrato che in tutti i campioni, il ceppo X è rimasto costantemente al di sotto delle deformazioni applicate.
La deformazione media nella direzione Y era approssimativamente zero per tutti gli incrementi, ma la deviazione standard era elevata. La deformazione media di taglio è aumentata costantemente durante gli incrementi di deformazione. Il punto più importante da ricordare è salvare le immagini prima di applicare uno sforzo maggiore.
Le immagini, se non salvate, vengono perse e non possono essere recuperate. Mentre questa tecnica è specificamente convalidata per misurare i ceppi tissutali all'interno dei tendini, può fornire informazioni sulla biologia meccanica e sulla meccanica di molti altri tessuti animali e umani.
