Este protocolo permite a mensuração das tensões teciduais locais dentro de um tendão durante a carga. É útil entender como os tendões se comportam mecanicamente e se adaptam ao seu ambiente de carga. A principal vantagem dessa técnica é que o software utilizado está disponível publicamente on-line e fornece feedback sobre a precisão da medição, mesmo quando as verdadeiras cepas teciduais são desconhecidas.
Medir as cepas de tecido locais em um tendão é valioso para entender como as células remodelam o tecido durante a degeneração e o reparo do tendão. Demonstrando esse procedimento estarão Stanton Godshall, um estudante de graduação, e Krishna Pedaprolu, um estudante de doutorado em meu laboratório. Depois de corar os tendões de Aquiles colhidos em DTAF, transferir o tecido da solução DTAF para a solução DRAQ5 e incubar os tecidos em um espaço escuro por 10 minutos à temperatura ambiente.
Coloque o tendão nas alças do dispositivo de carga de tração. Antes de montar as alças no dispositivo de carregamento, use pinças digitais para medir a distância entre o acessório calcâneo e a empunhadura oposta. Monte as alças no dispositivo de carregamento contendo PBS para manter a hidratação do tecido.
Alinhe o tendão da melhor forma possível com o eixo x ou o eixo y das imagens do microscópio de modo que as saídas de deformação X e tensão Y do algoritmo correspondam ao eixo tendão. Pré-carregue o tendão com um grama de tensão. Se desejar, foletar um conjunto de quatro linhas espaçadas a 80 mícrons de distância na região central do tecido e repetir o processo nos extremos esquerdo e direito perto das alças.
A mudança na distância entre as linhas em cada região do tecido é uma medida secundária das cepas teciduais locais que pode ser usada para validar os dados. Em seguida, utilizando o microscópio confocal, adquirir imagens volumétricas da fluorescência DTAF e DRAQ5 a um grama de pré-carga. Realize uma rampa de deformação para 2%strain a 0,5% por segundo.
Observe que a taxa de deformação e a magnitude da deformação incremental podem ser ajustadas. Depois de permitir que o tecido relaxe por 10 minutos, faça outra imagem volumétrica do tecido após a deformação. Repita o processo para quantos incrementos de tensão desejarem.
Para criar as imagens transformadas digitalmente, baixe o código digital_strain. m do GitHub. Após o download, abra e execute o código.
Quando solicitado, insira os valores desejados para a deformação máxima aplicada, o incremento de deformação aplicada e a razão de Poisson antes de pressionar OK. Em seguida, quando solicitado novamente, selecione a imagem de referência não deformada. Para cada incremento de deformação, uma sobreposição da imagem de referência e da imagem transformada é exibida. As imagens transformadas digitalmente serão salvas no diretório chamado deformação X por cento transformada digitalmente, onde X é o incremento de deformação.
Abra o script com o nome exibido e clique em Executar para iniciar a análise da imagem. Quando solicitado, altere os valores para a correlação de imagem digital Lagrangiana aumentada ou parâmetros ALDIC conforme desejado. Depois de ser solicitado, marque a caixa de seleção sim para salvar automaticamente o valor médio, o desvio padrão e o mapa 2D para a coleção desejada de variáveis.
Quando solicitado, selecione as variáveis desejadas, como deformação X, deformação Y, deformação de cisalhamento, regiões defeituosas, etc., e pressione OK. Após o próximo prompt, selecione a pasta que contém as projeções Z de intensidade máxima renomeadas. O software executa automaticamente ALDIC incremental para determinar os campos de deformação das imagens deformadas. Quando solicitado, clique com o botão esquerdo do mouse para criar um polígono de quatro pontos para definir a região de interesse para medir as deformação.
Os resultados do rastreamento nuclear da pasta, que podem ser renomeados ajustando as linhas 555 e 556, armazenam todos os gráficos especificados anteriormente. Essa pasta também contém uma planilha chamada resultados, que armazena todas as médias e desvios padrão especificados anteriormente. Quando validado usando imagens digitalmente tensas, o algoritmo ALDIC consistentemente subestimou a deformação X média e a magnitude do erro aumentou com o aumento da tensão aplicada.
A cepa Y também foi subestimada. No entanto, em todos os casos, a magnitude do erro de deformação foi muito pequena. O desvio padrão da deformação X e da cepa Y calculadas, embora de baixa magnitude, aumentou com o aumento da deformação aplicada.
A análise de região ruim revelou que o número de regiões defeituosas com cálculos de deformação inválidos nas imagens transformadas digitalmente analisadas usando o método cumulativo aumentou consistentemente após 6% de deformação aplicada, enquanto a quantidade incremental permaneceu em 1% Em uma das quatro amostras, que foi tratada como um outlier, quase metade da imagem foi identificada como ruim no incremento máximo de deformação. As cepas X calculadas pelo ALDIC foram maiores do que as determinadas a partir das PBLs, a diferença está dentro de 0,005, o que é semelhante ao desvio padrão para os dados PBL médios em todas as amostras. A determinação das magnitudes e distribuições espaciais das cepas locais nos tendões sob carga de tração mostrou que, em todas as amostras, a cepa X permaneceu consistentemente abaixo das cepas aplicadas.
A deformação média na direção Y foi aproximadamente zero para todos os incrementos, mas o desvio padrão foi alto. A deformação média de cisalhamento aumentou de forma constante ao longo dos incrementos de deformação. O ponto mais importante a lembrar é salvar as imagens antes de aplicar uma tensão maior.
As imagens, se não forem salvas, são perdidas e não podem ser recuperadas. Embora esta técnica seja validada especificamente para medir tensões de tecido dentro de tendões, ela pode fornecer informações sobre a biologia mecânica e mecânica de muitos outros tecidos animais e humanos.
