Ce protocole permet de mesurer les souches tissulaires locales dans un tendon pendant la charge. Il est utile de comprendre comment les tendons se comportent mécaniquement et s’adaptent à leur environnement de charge. Le principal avantage de cette technique est que le logiciel utilisé est accessible au public en ligne et fournit un retour d’information sur la précision de la mesure, même lorsque les vraies souches tissulaires sont inconnues.
La mesure des tensions tissulaires locales dans un tendon est utile pour comprendre comment les cellules remodèlent les tissus pendant la dégénérescence et la réparation des tendons. Stanton Godshall, un étudiant de premier cycle, et Krishna Pedaprolu, un étudiant au doctorat dans mon laboratoire, feront la démonstration de cette procédure. Après coloration des tendons d’Achille récoltés dans le DTAF, transférer le tissu de la solution DTAF à la solution DRAQ5 et incuber les tissus dans un espace sombre pendant 10 minutes à température ambiante.
Placer le tendon dans les poignées du dispositif de charge de traction. Avant de monter les poignées dans le dispositif de chargement, utilisez des étriers numériques pour mesurer la distance entre l’accessoire de calcanéum et la poignée opposée. Montez les poignées dans le dispositif de chargement contenant du PBS pour maintenir l’hydratation des tissus.
Alignez le tendon le mieux possible avec l’axe x ou l’axe y des images du microscope afin que les sorties de déformation X et de déformation Y de l’algorithme correspondent à l’axe tendineux. Préchargez le tendon avec un gramme de tension. Si vous le souhaitez, photoblanchissez un ensemble de quatre lignes espacées de 80 microns dans la région centrale du tissu et répétez le processus aux extrêmes gauche et droit près des poignées.
Le changement de distance entre les lignes dans chaque région tissulaire est une mesure secondaire des souches tissulaires locales qui peut être utilisée pour valider les données. Ensuite, à l’aide du microscope confocal, acquérir des images volumétriques de la fluorescence DTAF et DRAQ5 à un gramme de précharge. Effectuez une rampe de déformation à 2 % de déformation à 0,5 % par seconde.
Notez que la vitesse de déformation et l’amplitude de déformation incrémentielle peuvent être ajustées. Après avoir laissé le tissu se détendre pendant 10 minutes, prenez une autre image volumétrique du tissu après la déformation. Répétez le processus pour autant d’incréments de déformation que vous le souhaitez.
Pour créer les images transformées numériquement, téléchargez le code digital_strain. m de GitHub. Après le téléchargement, ouvrez et exécutez le code.
Lorsque vous y êtes invité, insérez les valeurs souhaitées pour la déformation maximale appliquée, l’incrément de déformation appliquée et le rapport de Poisson avant d’appuyer sur OK. Ensuite, lorsque vous y êtes invité à nouveau, sélectionnez l’image de référence non déformée. Pour chaque incrément de déformation, une superposition de l’image de référence et de l’image transformée est affichée. Les images transformées numériquement seront enregistrées dans le répertoire nommé Pourcentage de déformation X transformé numériquement où X est l’incrément de contrainte.
Ouvrez le script avec le nom affiché et cliquez sur Exécuter pour commencer l’analyse de l’image. Lorsque vous y êtes invité, modifiez les valeurs de la corrélation d’image numérique lagrangienne augmentée ou des paramètres ALDIC selon vos besoins. Après y avoir été invité, cochez la case oui pour enregistrer automatiquement la valeur moyenne, l’écart type et la carte 2D pour la collection de variables souhaitée.
Lorsque vous y êtes invité, sélectionnez les variables souhaitées telles que la déformation X, la déformation Y, la déformation de cisaillement, les régions défectueuses, etc., puis appuyez sur OK. À l’invite suivante, sélectionnez le dossier qui contient les projections d’intensité maximale Z renommées. Le logiciel effectue automatiquement un ALDIC incrémental pour déterminer les champs de déformation des images déformées. Lorsque vous y êtes invité, cliquez avec le bouton gauche de la souris pour créer un polygone à quatre points afin de définir la région d’intérêt pour mesurer les déformations.
Le dossier résultats du suivi nucléaire, qui peut être renommé en ajustant les lignes 555 et 556, stocke tous les graphiques spécifiés précédemment. Ce dossier contient également une feuille de calcul nommée résultats, qui stocke toutes les moyennes et les écarts-types spécifiés précédemment. Lorsqu’il a été validé à l’aide d’images filtrées numériquement, l’algorithme ALDIC sous-estimait systématiquement la déformation moyenne X et l’amplitude de l’erreur augmentait avec l’augmentation de la déformation appliquée.
La souche Y a également été largement sous-estimée. Cependant, dans tous les cas, l’ampleur de l’erreur de déformation était très faible. L’écart type de la déformation X et de la déformation Y calculées, bien que faible en ampleur, augmentait avec l’augmentation de la déformation appliquée.
L’analyse des régions défectueuses a révélé que le nombre de régions défectueuses ayant des calculs de déformation invalides dans les images transformées numériquement analysées à l’aide de la méthode cumulative augmentait régulièrement après l’application de 6 %, tandis que la quantité incrémentielle restait à 1 %Dans l’un des quatre échantillons, qui a été traité comme une valeur aberrante, près de la moitié de l’image a été identifiée comme mauvaise à l’incrément de déformation maximal. Les souches X calculées par ALDIC étaient plus grandes que celles déterminées à partir des PBL, la différence se situant à moins de 0,005, ce qui est similaire à l’écart-type pour les données PBL moyennées dans tous les échantillons. La détermination de l’amplitude et de la distribution spatiale des déformations locales dans les tendons sous charge de traction a montré que dans tous les échantillons, la déformation X restait systématiquement inférieure aux souches appliquées.
La déformation moyenne dans la direction Y était approximativement nulle pour tous les incréments, mais l’écart type était élevé. La déformation moyenne par cisaillement a augmenté régulièrement tout au long des incréments de déformation. Le point le plus important à retenir est de sauvegarder les images avant d’appliquer une plus grande contrainte.
Les images, si elles ne sont pas enregistrées, sont perdues et ne peuvent pas être récupérées. Bien que cette technique soit spécifiquement validée pour mesurer les souches tissulaires dans les tendons, elle peut donner un aperçu de la biologie mécanique et de la mécanique de nombreux autres tissus animaux et humains.
