Dieses Protokoll ermöglicht die Messung der lokalen Gewebebelastungen innerhalb einer Sehne während der Belastung. Es ist nützlich zu verstehen, wie sich Spannglieder mechanisch verhalten und sich an ihre Belastungsumgebung anpassen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die verwendete Software online öffentlich verfügbar ist und auch dann eine Rückmeldung über die Messgenauigkeit gibt, wenn die tatsächlichen Gewebestämme unbekannt sind.
Die Messung lokaler Gewebebelastungen in einer Sehne ist wertvoll, um zu verstehen, wie Zellen Gewebe während der Sehnendegeneration und -reparatur umgestalten. Dieses Verfahren wird von Stanton Godshall, einem Studenten, und Krishna Pedaprolu, einem Doktoranden in meinem Labor, demonstriert. Nachdem Sie die entnommenen Achillessehnen in DTAF gefärbt haben, übertragen Sie das Gewebe aus der DTAF-Lösung in die DRAQ5-Lösung und inkubieren Sie das Gewebe in einem dunklen Raum für 10 Minuten bei Raumtemperatur.
Legen Sie die Sehne in die Griffe der Zugbelastungsvorrichtung. Messen Sie vor der Montage der Griffe in der Ladevorrichtung mit digitalen Messschiebern den Abstand zwischen dem Fersenbeinaufsatz und dem gegenüberliegenden Griff. Montieren Sie die Griffe in der Ladevorrichtung, die PBS enthält, um die Hydratation des Gewebes aufrechtzuerhalten.
Richten Sie die Sehne so gut wie möglich an der x-Achse oder der y-Achse der Mikroskopbilder aus, so dass die X-Dehnungs- und Y-Dehnungsausgänge des Algorithmus mit der Sehnenachse übereinstimmen. Spannen Sie die Sehne mit einem Gramm Spannung vor. Falls gewünscht, photobleichen Sie einen Satz von vier Linien im Abstand von 80 Mikrometern im mittleren Bereich des Gewebes und wiederholen Sie den Vorgang am linken und rechten Ende in der Nähe der Griffe.
Die Änderung des Abstands zwischen den Linien in jeder Geweberegion ist eine sekundäre Messung der lokalen Gewebestämme, die zur Validierung der Daten verwendet werden kann. Als nächstes nehmen Sie mit dem konfokalen Mikroskop volumetrische Bilder der DTAF- und DRAQ5-Fluoreszenz bei einem Gramm Vorspannung auf. Führen Sie eine Dehnungsrampe auf 2 % Dehnung bei 0,5 % pro Sekunde durch.
Beachten Sie, dass die Dehnungsrate und die inkrementelle Dehnungsgröße angepasst werden können. Nachdem Sie das Gewebe 10 Minuten lang belastet haben, machen Sie nach der Verformung ein weiteres volumetrisches Bild des Gewebes. Wiederholen Sie den Vorgang für so viele Dehnungsschritte wie gewünscht.
Um die digital transformierten Bilder zu erstellen, laden Sie den Code digital_strain herunter. m von GitHub. Öffnen Sie nach dem Herunterladen den Code und führen Sie ihn aus.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, geben Sie die gewünschten Werte für die maximal angelegte Dehnung, das angewendete Dehnungsinkrement und das Poisson-Verhältnis ein, bevor Sie auf OK drücken. Wenn Sie dann erneut dazu aufgefordert werden, wählen Sie das unverformte Referenzbild aus. Für jedes Dehnungsinkrement wird eine Überlagerung des Referenzbildes und des transformierten Bildes angezeigt. Die digital transformierten Bilder werden in dem Verzeichnis mit dem Namen digital transformierte X-Prozent-Dehnung gespeichert, wobei X das Dehnungsinkrement ist.
Öffnen Sie das Skript mit dem angezeigten Namen und klicken Sie auf Ausführen, um die Bildanalyse zu starten. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, ändern Sie die Werte für die erweiterte digitale Lagrange-Bildkorrelation oder die ALDIC-Parameter wie gewünscht. Nachdem Sie dazu aufgefordert wurden, aktivieren Sie das Kontrollkästchen Ja, um den Mittelwert, die Standardabweichung und die 2D-Karte für die gewünschte Variablensammlung automatisch zu speichern.
Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie die gewünschten Variablen wie X-Dehnung, Y-Dehnung, Scherdehnung, schlechte Bereiche usw. aus und drücken Sie OK. Wählen Sie nach der nächsten Eingabeaufforderung den Ordner aus, der die umbenannten Z-Projektionen mit maximaler Intensität enthält. Die Software führt automatisch inkrementelles ALDIC durch, um die Dehnungsfelder der verformten Bilder zu bestimmen. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, klicken Sie mit der linken Maustaste, um ein Vier-Punkt-Polygon zu erstellen, um den Bereich zu definieren, der für die Messung der Dehnungen von Interesse ist.
Der Ordner Nuclear Tracking Results, der durch Anpassen der Zeilen 555 und 556 umbenannt werden kann, speichert alle zuvor angegebenen Plots. Dieser Ordner enthält auch eine Tabelle mit dem Namen results, in der alle zuvor angegebenen Mittelwerte und Standardabweichungen gespeichert sind. Bei der Validierung mit digital belasteten Bildern unterschätzte der ALDIC-Algorithmus die mittlere X-Dehnung konsequent und die Fehlergröße nahm mit zunehmender angewendeter Dehnung zu.
Auch der Y-Stamm wurde meist unterschätzt. In allen Fällen war das Ausmaß des Dehnungsfehlers jedoch sehr gering. Die Standardabweichung der berechneten X-Dehnung und Y-Dehnung nahm mit zunehmender aufgebrachter Dehnung zu, obwohl sie gering war.
Die Analyse der fehlerhaften Regionen ergab, dass die Anzahl der fehlerhaften Regionen mit ungültigen Dehnungsberechnungen in den digital transformierten Bildern, die mit der kumulativen Methode analysiert wurden, nach 6 % angewendeter Dehnung konsistent zunahm, während die inkrementelle Menge bei 1 % blieb. In einer der vier Proben, die als Ausreißer behandelt wurde, wurde fast die Hälfte des Bildes beim maximalen Dehnungsinkrement als schlecht identifiziert. Die von ALDIC berechneten X-Stämme waren größer als die aus den PBLs ermittelten, wobei die Differenz innerhalb von 0,005 lag, was der Standardabweichung für die PBL-Daten entspricht, die über alle Proben gemittelt wurden. Die Bestimmung der Größen und räumlichen Verteilungen der lokalen Dehnungen in den Spanngliedern unter Zugbelastung zeigte, dass die X-Dehnung über alle Proben hinweg konstant unter den aufgebrachten Dehnungen blieb.
Die mittlere Dehnung in Y-Richtung war für alle Inkremente ungefähr Null, aber die Standardabweichung war hoch. Die mittlere Scherdehnung nahm über die Dehnungsschritte hinweg stetig zu. Der wichtigste Punkt, an den Sie sich erinnern sollten, ist, die Bilder zu speichern, bevor Sie eine größere Belastung anwenden.
Die Bilder gehen, wenn sie nicht gespeichert werden, verloren und können nicht wiederhergestellt werden. Während diese Technik speziell für die Messung von Gewebestämmen innerhalb von Sehnen validiert ist, kann sie Einblicke in die mechanische Biologie und Mechanik vieler anderer tierischer und menschlicher Gewebe geben.
