이 프로토콜을 사용하면 로딩 중에 힘줄 내의 국소 조직 변형을 측정할 수 있습니다. 힘줄이 기계적으로 어떻게 행동하고 하중 환경에 적응하는지 이해하는 것이 유용합니다. 이 기술의 주요 장점은 사용된 소프트웨어가 온라인에서 공개적으로 사용 가능하며 실제 조직 균주를 알 수 없는 경우에도 측정 정확도에 대한 피드백을 제공한다는 것입니다.
힘줄의 국소 조직 변형을 측정하는 것은 힘줄이 변성되고 복구되는 동안 세포가 조직을 어떻게 리모델링하는지 이해하는 데 중요합니다. 이 절차를 시연하는 것은 학부생 인 Stanton Godshall과 내 실험실의 박사 과정 학생 인 Krishna Pedaprolu가 될 것입니다. 채취한 아킬레스건을 DTAF로 염색한 후 DTAF 용액에서 DRAQ5 용액으로 조직을 옮기고 실온에서 10분 동안 암실에서 조직을 배양합니다.
힘줄을 인장 하중 장치의 그립에 놓습니다. 로딩 장치에 그립을 장착하기 전에 디지털 캘리퍼스를 사용하여 종골 부착물과 반대쪽 그립 사이의 거리를 측정하십시오. 조직 수화를 유지하기 위해 PBS가 포함된 로딩 장치에 그립을 장착합니다.
알고리즘의 X 변형 및 Y 변형 출력이 힘줄 축과 일치하도록 현미경 이미지의 x축 또는 y축에 힘줄을 최대한 정렬합니다. 힘줄에 1g의 장력을 가하십시오. 원한다면, 조직의 중심 영역에서 80 미크론 간격으로 4개의 라인 세트를 광표백하고, 그립 근처의 왼쪽 및 오른쪽 극단에서 이 과정을 반복한다.
각 조직 영역에서 선 사이의 거리 변화는 데이터를 검증하는 데 사용할 수 있는 국소 조직 균주의 2차 측정입니다. 다음으로, 컨포칼 현미경을 사용하여 1g의 예압에서 DTAF 및 DRAQ5 형광의 체적 이미지를 획득합니다. 초당 0.5%의 속도로 2% 변형률로 스트레인 램프를 수행합니다.
변형률 속도와 증분 변형률 크기를 조정할 수 있습니다. 조직이 10분 동안 스트레스를 완화하도록 한 후 변형 후 조직의 또 다른 체적 이미지를 촬영합니다. 원하는 만큼 변형률 증가에 대해 이 과정을 반복합니다.
디지털로 변환된 이미지를 만들려면 digital_strain 코드를 다운로드하십시오. GitHub에서 m. 다운로드 후 코드를 열고 실행합니다.
메시지가 표시되면 OK를 누르기 전에 최대 적용 변형률, 적용된 변형률 증가 및 푸아송 비율에 대해 원하는 값을 삽입합니다. 그런 다음 메시지가 다시 표시되면 변형되지 않은 참조 이미지를 선택합니다. 각 변형률 증가에 대해 참조 이미지와 변환된 이미지의 오버레이가 표시됩니다. 디지털로 변환된 이미지는 디지털 변환된 X 퍼센트 변형률(여기서 X는 변형률 증가)이라는 디렉토리에 저장됩니다.
표시된 이름의 스크립트를 열고 실행을 클릭하여 이미지 분석을 시작합니다. 프롬프트가 표시되면 증강된 라그랑주 디지털 이미지 상관 관계 또는 ALDIC 매개변수의 값을 원하는 대로 변경합니다. 메시지가 표시되면 예 확인란을 선택하여 원하는 변수 집합에 대한 평균값, 표준 편차 및 2D 맵을 자동으로 저장합니다.
메시지가 표시되면 X 변형률, Y 변형률, 전단 변형률, 불량 영역 등과 같은 원하는 변수를 선택하고 확인을 누릅니다. 다음 프롬프트에 따라 이름이 바뀐 최대 강도 Z 투영이 포함된 폴더를 선택합니다. 소프트웨어는 자동으로 증분 ALDIC를 수행하여 변형된 이미지의 스트레인 필드를 결정합니다. 메시지가 표시되면 왼쪽 클릭하여 변형을 측정하기 위한 관심 영역을 정의하는 4점 다각형을 만듭니다.
555선과 556선을 조정하여 이름을 바꿀 수 있는 폴더 핵 추적 결과에는 이전에 지정한 모든 플롯이 저장됩니다. 이 폴더에는 이전에 지정한 모든 평균과 표준 편차를 저장하는 results라는 스프레드시트도 포함되어 있습니다. 디지털 변형 이미지를 사용하여 검증했을 때 ALDIC 알고리즘은 평균 X 변형률을 일관되게 과소평가했으며 적용 변형률이 증가함에 따라 오차 크기가 증가했습니다.
Y 균주도 대부분 과소평가되었습니다. 그러나 모든 경우에 변형률 오차의 크기는 매우 작았습니다. 계산된 X 변형률과 Y 변형률의 표준 편차는 크기는 작지만 적용된 변형률이 증가함에 따라 증가했습니다.
불량 영역 분석 결과, 누적 방법을 사용하여 분석한 디지털 변환 이미지에서 잘못된 변형률 계산이 있는 불량 영역의 수는 6% 적용 변형 후 지속적으로 증가한 반면, 증분량은 1%이상치로 처리된 4개의 샘플 중 하나에서 이미지의 거의 절반이 최대 변형률 증가에서 불량으로 식별되었습니다. ALDIC에 의해 계산된 X 균주는 PBL에서 측정된 것보다 컸으며, 그 차이는 0.005 이내였으며 이는 모든 샘플에서 평균화된 PBL 데이터의 표준 편차와 유사합니다. 인장 하중 하에서 힘줄의 국소 변형의 크기와 공간 분포를 결정하면 모든 샘플에서 X 변형이 적용된 변형률 아래에 일관되게 유지되는 것으로 나타났습니다.
Y 방향의 평균 변형률은 모든 증분에 대해 거의 0이었지만 표준 편차는 높았습니다. 평균 전단 변형률은 변형률 증가 전반에 걸쳐 꾸준히 증가했습니다. 기억해야 할 가장 중요한 점은 더 큰 변형을 적용하기 전에 이미지를 저장하는 것입니다.
저장하지 않으면 이미지가 손실되고 복구할 수 없습니다. 이 기술은 힘줄 내의 조직 변형을 측정하기 위해 특별히 검증되었지만 다른 많은 동물 및 인간 조직의 기계 생물학 및 역학에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다.
