Este protocolo permite la medición de las tensiones tisulares locales dentro de un tendón durante la carga. Es útil comprender cómo se comportan mecánicamente los tendones y se adaptan a su entorno de carga. La principal ventaja de esta técnica es que el software utilizado está disponible públicamente en línea y proporciona información sobre la precisión de la medición, incluso cuando se desconocen las verdaderas cepas de tejido.
La medición de las tensiones del tejido local en un tendón es valiosa para comprender cómo las células remodelan el tejido durante la degeneración y reparación del tendón. Demostrando este procedimiento estarán Stanton Godshall, un estudiante de pregrado, y Krishna Pedaprolu, un estudiante de doctorado en mi laboratorio. Después de teñir los tendones de Aquiles cosechados en DTAF, transfiera el tejido de la solución DTAF a la solución DRAQ5 e incube los tejidos en un espacio oscuro durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Coloque el tendón en las empuñaduras del dispositivo de carga de tracción. Antes de montar las empuñaduras en el dispositivo de carga, utilice pinzas digitales para medir la distancia entre el accesorio calcáneo y la empuñadura opuesta. Monte las empuñaduras en el dispositivo de carga que contiene PBS para mantener la hidratación del tejido.
Alinee el tendón lo mejor posible con el eje x o el eje y de las imágenes del microscopio para que las salidas de deformación X y deformación Y del algoritmo se correspondan con el eje del tendón. Precargar el tendón con un gramo de tensión. Si lo desea, fotoblanquee un conjunto de cuatro líneas separadas 80 micras en la región central del tejido, y repita el proceso en los extremos izquierdo y derecho cerca de los agarres.
El cambio en la distancia entre las líneas en cada región del tejido es una medida secundaria de las cepas tisulares locales que se pueden utilizar para validar los datos. A continuación, utilizando el microscopio confocal, adquiera imágenes volumétricas de la fluorescencia DTAF y DRAQ5 a un gramo de precarga. Realice una rampa de deformación al 2% de deformación al 0,5% por segundo.
Tenga en cuenta que la velocidad de deformación y la magnitud de deformación incremental se pueden ajustar. Después de permitir que el tejido se relaje durante 10 minutos, tome otra imagen volumétrica del tejido después de la deformación. Repita el proceso para tantos incrementos de deformación como desee.
Para crear las imágenes transformadas digitalmente, descargue el código digital_strain. m de GitHub. Después de descargar, abra y ejecute el código.
Cuando se le solicite, inserte los valores deseados para la deformación máxima aplicada, el incremento de deformación aplicada y la relación de Poisson antes de presionar OK. A continuación, cuando se le solicite de nuevo, seleccione la imagen de referencia sin deformar. Para cada incremento de deformación, se muestra una superposición de la imagen de referencia y la imagen transformada. Las imágenes transformadas digitalmente se guardarán en el directorio denominado deformación X por ciento transformada digitalmente donde X es el incremento de deformación.
Abra el script con el nombre mostrado y haga clic en Ejecutar para comenzar el análisis de imágenes. Cuando se le solicite, modifique los valores de la correlación de imagen digital lagrangiana aumentada o los parámetros ALDIC como desee. Después de que se le solicite, seleccione la casilla de verificación sí para guardar automáticamente el valor medio, la desviación estándar y el mapa 2D para la colección deseada de variables.
Cuando se le solicite, seleccione las variables deseadas como deformación X, deformación Y, deformación cortante, regiones defectuosas, etc., y pulse OK. Siguiendo el siguiente mensaje, seleccione la carpeta que contiene las proyecciones Z de intensidad máxima cuyo nombre ha cambiado. El software realiza automáticamente ALDIC incremental para determinar los campos de deformación de las imágenes deformadas. Cuando se le solicite, haga clic izquierdo para crear un polígono de cuatro puntos para definir la región de interés para medir las cepas.
La carpeta resultados del seguimiento nuclear, que se puede renombrar ajustando las líneas 555 y 556, almacena todas las gráficas especificadas anteriormente. Esta carpeta también contiene una hoja de cálculo denominada resultados, que almacena todas las medias y desviaciones estándar especificadas anteriormente. Cuando se validó utilizando imágenes forzadas digitalmente, el algoritmo ALDIC subestimó consistentemente la deformación X media y la magnitud del error aumentó con el aumento de la tensión aplicada.
La cepa Y también fue subestimada en su mayoría. Sin embargo, en todos los casos, la magnitud del error de deformación fue muy pequeña. La desviación estándar de la deformación X calculada y la deformación Y, aunque baja en magnitud, aumentó con el aumento de la tensión aplicada.
El análisis de la región defectuosa reveló que el número de regiones malas que tenían cálculos de deformación no válidos en las imágenes transformadas digitalmente analizadas utilizando el método acumulativo aumentó constantemente después de aplicar el 6%, mientras que la cantidad incremental se mantuvo en el 1%En una de las cuatro muestras, que se trató como un valor atípico, casi la mitad de la imagen se identificó como mala en el incremento máximo de deformación. Las cepas X calculadas por ALDIC fueron mayores que las determinadas a partir de las PBL, la diferencia está dentro de 0.005, que es similar a la desviación estándar para los datos de PBL promediados en todas las muestras. La determinación de las magnitudes y distribuciones espaciales de las deformaciones locales en los tendones bajo carga de tracción mostró que en todas las muestras, la deformación X permaneció consistentemente por debajo de las deformaciones aplicadas.
La deformación media en la dirección Y fue aproximadamente cero para todos los incrementos, pero la desviación estándar fue alta. La deformación media de cizallamiento aumentó constantemente a lo largo de los incrementos de deformación. El punto más importante a recordar es guardar las imágenes antes de aplicar una tensión mayor.
Las imágenes, si no se guardan, se pierden y no se pueden recuperar. Si bien esta técnica está específicamente validada para medir las tensiones tisulares dentro de los tendones, puede proporcionar información sobre la biología mecánica y la mecánica de muchos otros tejidos animales y humanos.
