Bu protokol, ışık geçirgenliği elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak RP patolojileri için fare boyutunun nasıl işleneceğini ve değerlendirileceğini açıklayan ilk protokoldür. Bu protokolün temel avantajı, RP patolojilerinin kantitatif değerlendirmelerinin dahil edilmesi, istatistiksel karşılaştırmalar için bu üç görüntüleme tekniğinin kullanılmasıdır. Bu protokolde açıklanan teknikler, RPE sağlığı için önemli olan moleküler yollar hakkındaki bilgimizi genişletmeye de yardımcı olabilir.
Daha önce fare boyutunu disseke etmemiş kişiler bu protokolle mücadele edebilir. Bu bireylere, bu protokolde açıklanan tekniklerde ustalaşmak için bazı farelerle pratik yapmalarını öneririz. Başlamak için, bir duman başlığında kardiyak perfüzyon için emici bir alt ped üzerinde bir yerçekimi besleme perfüzyon sistemi hazırlayın.
Perfüzyon sisteminin şırınga fıçısına 40 mililitre taze hazırlanmış fiksatif tampon dökün. Tamponun boru hattından akmasına izin vermek için vanayı boru hattına paralel olarak çevirin. Tüm hava kabarcıkları hattan çıkarılana kadar çizgiyi yıkayın.
Ardından, tamponun boru hattına akmasını önlemek için valfi boru hattına dik olarak çevirin. Kardiyak perfüzyon gerçekleştirmek için, ötenazi fareyi perfüzyon sisteminin yakınındaki sığ bir tepsiye aktarın. Karın yukarı bakacak şekilde.
Karnı% 70 etanol ile püskürtün, ardından göğüs kafesinin altındaki farenin sol tarafındaki deri ve karın duvarından kavisli makas ve forseps kullanarak beş santimetre aşağı kesim oluşturun. Alt kesimin üstündeki cilt ve karın duvarından üç santimetrelik bir medial kesim yapmaya devam edin. Medialin sonunda, göğüs kafesinin altındaki farenin en uzak sağ tarafındaki deri ve karın duvarından beş santimetre daha aşağı kesim yapın.
Kavisli forsepsli abdominal cilt flebini çıkarmak için üç santimetrelik bir medial kesi daha yapın. Daha sonra, kalbi açığa çıkarmak için diyaframı ve sternumu kesin. Gösterge iğnesini kalbin sol ventrikülüne yerleştirin ve kapağı çevirin.
Kanın ve fiksatifin kalpten çıkmasına izin vermek için sağ atriyumu kavisli makasla kesin. 10 mililitre fiksatif tamponun fareyi bir ila iki dakika boyunca veya karaciğerin rengi soluklaşana ve sağ atriyumdan kan akmayana kadar perfüze etmesine izin verin. Perfüzyon tamamlandıktan sonra, tampon akışını durdurmak için vanayı boru hattına dik olarak çevirin.
Gözleri çekirdeklendirmek için, fareyi sığ tepsiden çıkarın ve bir duman başlığındaki emici alt pedin üzerine yerleştirin. Ardından, farenin kafasını sol gözü deneyciye bakacak ve sağ gözü görüş alanı dışında olacak şekilde yönlendirin. Gözün üst tarafına bir doku işaretleme boyası ile açıklama ekleyin.
Gözün göz yuvasından çıkıntı yapması için başparmak ve işaret parmağınızla göz yuvasının etrafını yavaşça aşağı doğru itin. Daha sonra kavisli makas kullanarak, gözü bıçakla göz yuvasından 30 derecelik bir açıyla tutun ve gözün etrafını kesin. Göz küresini kavisli forseps ile kafadan çıkarın ve emici bir alt pedin üzerine yerleştirin.
Korneayı 11 numaralı neşter bıçağı ile çırpın ve kavisli forsepsli gözü iki mililitre fiksatif tampon içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Her iki gözü de çekirdeklendirdikten sonra, onları 75 rpm hızında dört derecelik bir odada bir çalkalayıcı üzerinde gece boyunca fiksatif bir tamponda inkübe edin. Ertesi gün, fiksatif tamponu iki mililitre PBS ile değiştirin ve oda sıcaklığında ve 75 rpm'de bir çalkalayıcıda 10 dakika inkübe edin.
Posterior segmentler oluşturmanın yanında, gözü diseksiyon mikroskobu altında PBS ile doldurulmuş bir Petri kabına yerleştirin. Herhangi bir yağ ve kası ince uçlu forsepslerle göz küresinden yavaşça kaldırın. Göz küresi düzgün bir mavimsi-siyah renge sahip olana kadar yağ ve kası mikro diseksiyon makası ile göz küresine paralel bir yönde dikkatlice kesin Kornea delinme bölgesine ince uçlu forsepsler yerleştirin ve kornea ve irisi göz küresinden çıkarmak için delinme bölgesinden başlayarak korneanın çevresini mikro disseksiyon makası ile kesin.
Daha sonra ince uçlu forseps kullanarak, arka segmenti oluşturmak için lensi göz küresinden yavaşça çıkarın. Arka segmenti iki mililitre PBS içeren bir tüpe yerleştirin ve kullanıma kadar buzdolabında dört santigrat derecede saklayın. Gözü PBS içeren bir Petri kabına aktarın ve gösterildiği gibi kornea ve irisi çıkarın.
İnce uçlu forsepslerle lensi dışarı çekin. Daha sonra iki ince uçlu forseps kullanarak, nöral retinayı arka segmentten yavaşça ayırın. Arka göz kepçesinden çıkarmak için optik sinir başındaki nöral retinayı dikkatlice kesin.
Göz kabini beş mikrolitre PBS içeren iki mililitrelik bir mikro tüpe yerleştirin. Arka göz kaplarını sabitlemek için, dokuya 500 mikrolitre metanol ekleyin ve beş dakika boyunca 75 rpm'de bir çalkalayıcı üzerinde inkübe edin. Metanol fiksasyonunu iki saat boyunca son inkübasyonla üç kez tekrarlayın.
Fiksasyondan sonra, konfokal mikroskopi ile immünofloresan boyama ve görselleştirmeye geçmeden önce dokuyu PBS ile üç kez yıkayın. Dört aylık TMEM 135 TG fareleri, retinal pigmentli epitel veya RPE kalınlığında, optik sinirden 600 ve 900 mikrometre uzaklıkta, yaşa uygun vahşi tip farelere göre anlamlı bir azalma gösterdi. 325 günlük WT ve TMEM 135 TG farelerin mikrovasküolizasyonu, makrovakuolizasyonu ve migrasyonunu içeren RPE patolojilerinin vakaları hesaplandı.
RPE mikrovakuolizasyonunun ortalama sıklığı, TMEM 135 TG farelere kıyasla vahşi tipte daha düşüktü. TMEM 135 TG farelerde gözlenen ortalama değerlere kıyasla vahşi tipte RPE makrovakuolizasyonu ve migrasyonu tespit edilmedi. Transmisyon elektron mikroskobunda 24 aylık retinalarda bazal laminer birikintiler gözlenirken, iki aylık retinalarda yoktu.
Bazal laminer birikinti yüksekliklerinin kümülatif frekanslarının analizi, 24 aylık farelerde birikintilerde bir artış olduğunu göstererek, iki aylık olana kıyasla, 24 aylık için çizginin sağına doğru bir kayma olduğunu göstermiştir. Bu gözlem, 24 aylık retinalarda daha büyük ortalama yüksekliklerle desteklendi. Dört aylık TMEM 135 TG farelerde RPE dismorfikti.
TMEM 135 TG retinalarındaki RPE, yaşa uygun vahşi tip retinalardan daha büyük ve daha az yoğundur. Ayrıca, TG retinalarında kontrollere kıyasla daha fazla çok çekirdekli RPE hücresi gözlendi. Bu protokolü takiben araştırmacılar, farelerde moleküler biyoloji tekniklerini kullanarak spesifik yolları değerlendirebilir ve bu da bu RP patolojilerinin farelerde nasıl geliştiğini anlamamıza katkıda bulunabilir.
Bu protokol, farelerde RP fenotiplemesinin standartlaştırılmasına yardımcı olacak, bu da fare çalışmalarından elde edilen bulguları diğer AMD modellerine çevirecek ve AMD patobiyolojisini anlamamıza yardımcı olacaktır.
