Этот протокол является первым, в котором описано, как обрабатывать и оценивать размер мыши для патологий RP с использованием светопропускающей, электронной и конфокальной микроскопии. Основным преимуществом этого протокола является включение количественных оценок патологий RP с использованием этих трех методов визуализации для статистических сравнений. Методы, описанные в этом протоколе, также могут помочь расширить наши знания о молекулярных путях, важных для здоровья RPE.
Люди, которые ранее не препарировали размер мыши, могут столкнуться с трудностями при работе с этим протоколом. Мы предлагаем этим людям попрактиковаться с некоторыми мышами, чтобы освоить методы, описанные в этом протоколе. Для начала подготовьте гравитационную систему перфузии на абсорбирующей подкладке для сердечной перфузии в вытяжном шкафу.
Налейте 40 миллилитров свежеприготовленного фиксирующего буфера в цилиндр шприца перфузионной системы. Поверните клапан параллельно трубопроводной линии, чтобы буфер протекал через трубопроводную линию. Промывайте леску до тех пор, пока из нее не будут удалены все пузырьки воздуха.
Затем поверните клапан перпендикулярно трубопроводной линии, чтобы буфер не поступал в трубопровод трубки. Чтобы выполнить сердечную перфузию, перенесите усыпленную мышь в неглубокий лоток рядом с перфузионной системой. Животом вверх.
Распылите на живот 70% этанол, затем создайте разрез на пять сантиметров ниже, используя изогнутые ножницы и щипцы через кожу и брюшную стенку с левой стороны мыши ниже грудной клетки. Приступайте к трехсантиметровому медиальному разрезу кожи и брюшной стенки в верхней части нижнего разреза. Сделайте еще один пятисантиметровый нижний разрез на конце медиального разреза через кожу и брюшную стенку с самой дальней правой стороны мыши ниже грудной клетки.
Сделайте еще один трехсантиметровый медиальный разрез, чтобы удалить кожный лоскут живота изогнутыми щипцами. Затем прорежьте диафрагму и грудину, чтобы обнажить сердце. Вставьте манометрическую иглу в левый желудочек сердца и поверните клапан.
Разрежьте правое предсердие изогнутыми ножницами, чтобы кровь и фиксатор выходили из сердца. Дайте 10 миллилитрам фиксирующего буфера перфузировать мышь в течение одной-двух минут или до тех пор, пока печень не станет бледной и кровь не начнет вытекать из правого предсердия. После завершения перфузии поверните клапан перпендикулярно трубопроводной линии, чтобы остановить буферный поток.
Чтобы зажечь глаза, извлеките мышь из неглубокого лотка и поместите ее на впитывающую подкладку в вытяжном шкафу. Затем сориентируйте голову мыши так, чтобы левый глаз был обращен к экспериментатору, а правый глаз был вне поля зрения. Аннотируйте верхнюю сторону глаза тканевым маркировочным красителем.
Аккуратно надавите на глазницу большим и указательным пальцами, чтобы выпячивание глаза из глазницы. Затем с помощью изогнутых ножниц держите глаз лезвием под углом 30 градусов от глазницы и разрежьте вокруг глаза. Извлеките глазное яблоко из головы изогнутыми щипцами и поместите его на впитывающую подкладку.
Прорежьте роговицу лезвием скальпеля No 11 и поместите глаз изогнутыми щипцами в двухмиллилитровую микротрубку, содержащую два миллилитра фиксирующего буфера. После зарождения обоих глаз инкубируйте их в фиксирующем буфере в течение ночи на шейкере в четырехградусной комнате со скоростью 75 об / мин. На следующий день замените фиксирующий буфер двумя миллилитрами PBS и выдерживайте в течение 10 минут на шейкере при комнатной температуре и 75 об/мин.
Затем, чтобы создать задние сегменты, поместите глаз в чашку Петри, наполненную PBS, под препарирующим микроскопом. Аккуратно отодвиньте жир и мышцы от глазного яблока щипцами с тонкими наконечниками. Аккуратно обрежьте жир и мышцы микрорассекающими ножницами параллельно глазному яблоку, пока глазное яблоко не приобретет однородный голубовато-черный цвет. Поместите щипцы с тонкими наконечниками в место прокола роговицы и разрежьте по периметру роговицы, начиная с места прокола, микрорассекающими ножницами, чтобы удалить роговицу и радужную оболочку из глазного яблока.
Затем, используя щипцы с тонкими наконечниками, осторожно извлеките хрусталик из глазного яблока, чтобы получить задний сегмент. Поместите задний сегмент в пробирку, содержащую два миллилитра PBS, и храните при температуре четыре градуса Цельсия в холодильнике до использования. Перенесите глаз в чашку Петри, содержащую PBS, и удалите роговицу и радужную оболочку, как показано на рисунке.
Вытащите линзу щипцами с тонкими наконечниками. Затем с помощью двух щипцов с тонкими наконечниками аккуратно отделите нервную сетчатку от заднего сегмента. Аккуратно разрежьте нервную сетчатку в головке зрительного нерва для удаления из задней чашки глаза.
Поместите наглазник в двухмиллилитровую микротрубку, содержащую пять микролитров PBS. Чтобы зафиксировать задние чашечки глаз, добавьте в ткань 500 микролитров метанола и инкубируйте на шейкере при 75 оборотах в минуту в течение пяти минут. Трижды повторить фиксацию метанола с окончательной инкубацией в течение двух часов.
После фиксации трижды промойте ткань PBS, прежде чем приступить к иммунофлюоресцентному окрашиванию и визуализации с помощью конфокальной микроскопии. Четырехмесячные мыши TMEM 135 TG показали значительное уменьшение толщины пигментного эпителия сетчатки или RPE на расстоянии 600 и 900 микрометров от зрительного нерва по сравнению с мышами дикого типа того же возраста. Были рассчитаны случаи патологий РПЭ, включая микроваскуолизацию, макровакуолизацию и миграцию 325-дневных мышей WT и TMEM 135 TG.
Средняя частота микровакуолизации РПЭ была ниже в диком типе по сравнению с мышами TMEM 135 TG. Макровакуолизация и миграция РПЭ не были обнаружены в диком типе по сравнению со средними значениями, наблюдаемыми у мышей TMEM 135 TG. При просвечивающей электронной микроскопии базальные ламинарные отложения наблюдались в сетчатке 24-месячного возраста, которые отсутствовали в сетчатке двухмесячного возраста.
Анализ кумулятивных частот высот базальных ламинарных отложений показал сдвиг вправо от линии для 24-месячного возраста по сравнению с двухмесячным, демонстрируя увеличение отложений у 24-месячных мышей. Это наблюдение было подтверждено более высокими средними высотами сетчатки 24-месячного возраста. RPE у четырехмесячных мышей TMEM 135 TG был дисморфическим.
RPE в сетчатках TMEM 135 TG больше и менее плотные, чем сетчатки дикого типа соответствующего возраста. Кроме того, наблюдалось больше многоядерных клеток RPE в сетчатке ТГ по сравнению с контрольной группой. Следуя этому протоколу, исследователи могли бы оценить конкретные пути, используя методы молекулярной биологии у мышей, что может способствовать нашему пониманию того, как эти патологии RP развиваются у мышей.
Этот протокол поможет стандартизировать фенотипирование RP у мышей, что переведет результаты исследований на мышах на другие модели ВМД и поможет нам понять патобиологию ВМД.
