该协议是第一个描述如何使用透光电子和共聚焦显微镜处理和评估RP病理学的小鼠大小的协议。该协议的主要优点是包括对RP病理的定量评估，使用这三种成像技术进行统计比较。本协议中描述的技术也可能有助于扩展我们对RPE健康重要的分子途径的了解。
以前没有解剖过小鼠大小的个体可能会与该协议作斗争。我们建议这些人与一些小鼠一起练习，以掌握本协议中描述的技术。首先，在吸收性垫上准备重力进料灌注系统，以便在通风橱中进行心脏灌注。
将40毫升新鲜制备的固定缓冲液倒入灌注系统的注射器筒中。将阀门平行于管路转动，使缓冲液流过管路。冲洗管路，直到从管路中去除所有气泡。
然后将阀门垂直于管路转动，以阻止缓冲器流入管路。要进行心脏灌注，请将安乐死的小鼠转移到灌注系统附近的浅托盘中。腹部朝上。
用70%乙醇喷洒腹部，然后使用弯曲的剪刀和镊子穿过肋骨下方小鼠左侧的皮肤和腹壁，形成一个5厘米的下切口。继续在下切口顶部的皮肤和腹壁上做一个三厘米的内侧切口。在内侧切口末端再做一个五厘米的下切口，穿过肋骨下方小鼠最远右侧的皮肤和腹壁。
再做一个三厘米的内侧切口，用弯曲的镊子去除腹部皮瓣。接下来，切开横膈膜和胸骨，露出心脏。将仪表针插入心脏的左心室并转动瓣膜。
用弯曲的剪刀剪开右心房，让血液和固定剂排出心脏。允许10毫升固定缓冲液灌注小鼠一到两分钟，或直到肝脏变得苍白并且没有血液流出右心房。灌注完成后，垂直于管路转动阀门以停止缓冲流。
要使眼睛成核，请将鼠标从浅托盘中取出，然后将其放在通风橱中的吸收垫上。然后将鼠标头部定向，左眼朝向实验者，右眼远离视线。用组织标记染料注释眼睛的上侧。
用拇指和食指轻轻向下推眼窝周围，使眼睛从眼窝突出。然后使用弯曲的剪刀，用刀片将眼睛与眼窝成30度角，并在眼睛周围剪裁。用弯曲的镊子从头部取出眼球，并将其放在吸收性垫上。
用 11 号手术刀刀片切开角膜，并用弯曲的镊子将眼睛放入含有 2 毫升固定缓冲液的 2 毫升微管中。双眼成核后，在四度房间的摇床上以75rpm的速度将它们在固定缓冲液中孵育过夜。第二天，用两毫升PBS替换固定缓冲液，并在室温和75rpm的摇床上孵育10分钟。
接下来要生成后节，将眼睛放入充满PBS的培养皿中，并在解剖显微镜下。用细尖镊子轻轻地将任何脂肪和肌肉从眼球上移开。用与眼球平行的微型解剖剪刀小心地修剪脂肪和肌肉，直到眼球具有均匀的蓝黑色 将细尖镊子放在角膜穿刺部位，然后用微型解剖剪刀从穿刺部位开始在角膜周边切割，以去除眼球上的角膜和虹膜。
然后使用细尖镊子，轻轻地将晶状体从眼球上取下，以产生后段。将后段放入含有两毫升PBS的管中，并在4摄氏度下储存在冰箱中直至使用。如图所示将眼睛转移到含有PBS的培养皿上，并如图所示去除角膜和虹膜。
用细尖镊子拉出镜片。然后使用两个细尖的镊子，轻轻地将神经视网膜与后段分开。小心地切割视神经头处的神经视网膜，以便从后眼杯中取出。
将眼罩放入含有五微升PBS的两毫升微管中。要固定后眼杯，向组织中加入 500 微升甲醇，并在摇床上以 75 rpm 孵育五分钟。重复甲醇固定三次，最终孵育两小时。
固定后，用PBS洗涤组织三次，然后进行免疫荧光染色并通过共聚焦显微镜进行可视化。四个月大的TMEM 135 TG小鼠，相对于年龄匹配的野生型小鼠，在距离视神经600和900微米处显示视网膜色素上皮或RPE厚度显着减少。计算325日龄WT和TMEM 135 TG小鼠的RPE病理事件，包括微血管化，大空泡化和迁移。
与TMEM 135 TG小鼠相比，野生型RPE微空泡化的平均频率较低。与TMEM 135 TG小鼠观察到的平均值相比，野生型未检测到RPE大空泡化和迁移。在透射电子显微镜中，在24个月大的视网膜中观察到基底层沉积物，而在两个月大的视网膜中不存在。
对基底层流沉积物高度的累积频率的分析表明，与两个月大的小鼠相比，24个月大的小鼠向线右侧移动，表明24个月大的小鼠的沉积物增加。这一观察结果得到了24个月大的视网膜中较大的平均高度的支持。四个月大的TMEM 135 TG小鼠的RPE畸形。
TMEM 135 TG视网膜的RPE比年龄匹配的野生型视网膜更大，密度更低。此外，与对照组相比，在TG视网膜中观察到更多的多核RPE细胞。遵循该协议，研究人员可以使用分子生物学技术在小鼠中评估特定途径，这可能有助于我们了解这些RP病理如何在小鼠中发展。
该协议将有助于标准化小鼠的RP表型，这将把小鼠研究的结果转化为其他AMD模型，并有助于我们理解AMD病理生物学。
