이 프로토콜은 광 투과 전자 및 공초점 현미경을 사용하여 RP 병리에 대한 마우스 크기를 처리하고 평가하는 방법을 설명하는 최초의 프로토콜입니다. 이 프로토콜의 주요 장점은 통계적 비교를 위해 이 세 가지 이미징 기술을 사용하여 RP 병리의 정량적 평가를 포함한다는 것입니다. 이 프로토콜에 설명된 기술은 또한 RPE 건강에 중요한 분자 경로에 대한 지식을 확장하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이전에 마우스 크기를 해부하지 않은 개인은 이 프로토콜에 어려움을 겪을 수 있습니다. 우리는 이러한 개인이 이 프로토콜에 설명된 기술을 마스터하기 위해 일부 마우스로 연습할 것을 제안합니다. 시작하려면 흄 후드의 심장 관류를 위한 흡수성 언더패드에 중력 공급 관류 시스템을 준비합니다.
갓 준비한 고정 완충액 40ml를 관류 시스템의 주사기 배럴에 붓습니다. 버퍼가 튜빙 라인을 통해 흐를 수 있도록 밸브를 튜빙 라인과 평행하게 돌립니다. 라인에서 모든 기포가 제거될 때까지 라인을 세척합니다.
그런 다음 밸브를 튜빙 라인에 수직으로 돌려 버퍼가 튜빙 라인으로 흐르는 것을 막습니다. 심장 관류를 수행하려면 안락사 된 마우스를 관류 시스템 근처의 얕은 트레이로 옮깁니다. 복부가 위를 향하게.
복부에 70 % 에탄올을 뿌린 다음 구부러진 가위와 집게를 사용하여 흉곽 아래 마우스 왼쪽의 피부와 복벽을 통해 5cm 하부 절단을 만듭니다. 하부 절개 상단의 피부와 복벽을 통해 3 센티미터의 내측 절개를 진행하십시오. 흉곽 아래 마우스의 가장 오른쪽에 있는 피부와 복벽을 통해 내측 절개 끝에서 5cm 더 하부 절개를 합니다.
구부러진 집게로 복부 피부 플랩을 제거하기 위해 또 다른 3cm 내측 절개를하십시오. 다음으로 횡격막과 흉골을 잘라 심장을 노출시킵니다. 게이지 바늘을 심장의 좌심실에 삽입하고 밸브를 돌립니다.
구부러진 가위로 우심방을 잘라 혈액과 고정제가 심장에서 빠져 나갈 수 있도록합니다. 10 밀리리터의 고정 완충액을 1-2 분 동안 또는 간이 옅은 색으로 변하고 우심방에서 혈액이 흘러 나오지 않을 때까지 마우스를 관류시킵니다. 관류가 완료되면 밸브를 튜빙 라인에 수직으로 돌려 버퍼 흐름을 중지합니다.
눈을 핵으로 만들려면 얕은 트레이에서 마우스를 꺼내 흄 후드의 흡수성 언더 패드에 놓습니다. 그런 다음 왼쪽 눈이 실험자를 향하고 오른쪽 눈이 보이지 않도록 마우스의 머리 방향을 지정합니다. 눈의 위쪽에 티슈 마킹 염료로 주석을 답니다.
엄지와 검지로 눈구멍 주위를 부드럽게 눌러 눈구멍에서 눈이 튀어나오도록 합니다. 그런 다음 구부러진 가위를 사용하여 칼날로 눈 소켓에서 30도 각도로 눈을 잡고 눈 주위를 자릅니다. 구부러진 집게로 머리에서 안구를 제거하고 흡수성 언더 패드에 놓습니다.
11번 메스 날로 각막에 닉을 꽂고 구부러진 집게가 있는 눈을 2밀리리터의 고정 완충액이 들어 있는 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 양쪽 눈을 핵으로 만든 후 4도 방의 셰이커에서 75rpm의 속도로 하룻밤 동안 고정 완충액에서 배양합니다. 다음날, 고정 완충액을 2밀리리터의 PBS로 교체하고, 실온 및 75 rpm에서 쉐이커 상에서 10분 동안 인큐베이션한다.
다음으로 후방 세그먼트를 생성하기 위해 해부 현미경으로 PBS로 채워진 페트리 접시에 눈을 놓습니다. 끝이 가는 집게로 안구에서 지방과 근육을 부드럽게 들어 올립니다. 안구가 균일한 청흑색이 될 때까지 미세 해부 가위로 안구와 평행 방향으로 지방과 근육을 조심스럽게 다듬습니다. 끝이 가는 집게를 각막 천자 부위에 놓고 미세 해부 가위로 천자 부위부터 각막 주변을 잘라 안구에서 각막과 홍채를 제거합니다.
그런 다음 끝이 가는 집게를 사용하여 안구에서 수정체를 부드럽게 제거하여 뒤쪽 부분을 만듭니다. 뒤쪽 세그먼트를 2밀리리터 PBS가 들어 있는 튜브에 넣고 사용할 때까지 섭씨 4도에서 냉장고에 보관하십시오. PBS가 들어 있는 페트리 접시에 눈을 옮기고 그림과 같이 각막과 홍채를 제거합니다.
끝이 가는 집게로 렌즈를 당겨 빼냅니다. 그런 다음 두 개의 미세한 집게를 사용하여 신경 망막을 뒤쪽 부분에서 부드럽게 분리합니다. 후방 안구 컵에서 제거하기 위해 시신경 머리에서 신경 망막을 조심스럽게 자릅니다.
아이컵을 5마이크로리터의 PBS가 들어 있는 2밀리리터 마이크로 튜브에 넣습니다. 후방 아이컵을 고정하려면 500마이크로리터의 메탄올을 조직에 넣고 75rpm의 셰이커에서 5분 동안 배양합니다. 메탄올 고정을 3회 반복하여 2시간 동안 최종 인큐베이션합니다.
고정 후 PBS로 조직을 세 번 세척한 후 면역형광염색을 진행하고 공초점 현미경을 통해 시각화합니다. 4개월령 TMEM 135 TG 마우스는 연령 일치 야생형 마우스에 비해 시신경으로부터 600 및 900 마이크로미터 떨어진 곳에서 망막 색소 상피 또는 RPE 두께의 현저한 감소를 보였다. 미세혈관 형성, 거대 혈관 화 및 325 일 된 WT 및 TMEM 135 TG 마우스의 이동을 포함한 RPE 병리의 사건을 계산했습니다.
RPE 미세 공포화의 평균 빈도는 TMEM 135 TG 마우스에 비해 야생형에서 더 낮았다. TMEM 135 TG 마우스에서 관찰된 평균값과 비교하여 야생형에서 RPE macrovacuolization 및 이동이 검출되지 않았습니다. 투과 전자 현미경 검사에서, 2 개월 된 망막에는 없었던 24 개월 된 망막에서 기저 층류 침전물이 관찰되었다.
기저층 퇴적물 높이의 누적 빈도를 분석한 결과, 24개월 된 마우스에 비해 24개월 된 마우스의 선이 오른쪽으로 이동하는 것으로 나타났으며, 이는 24개월 된 마우스의 침전물 증가를 보여줍니다. 이 관찰은 24개월 된 망막의 더 큰 평균 높이에 의해 뒷받침되었습니다. 4개월령 TMEM 135 TG 마우스의 RPE는 이형성이었다.
TMEM 135 TG 망막의 RPE는 연령 일치 야생형 망막보다 크고 밀도가 낮습니다. 또한, 대조군에 비해 TG 망막에서 더 많은 다핵 RPE 세포가 관찰되었습니다. 이 프로토콜에 따라 연구자들은 생쥐에서 분자 생물학 기술을 사용하여 특정 경로를 평가할 수 있으며, 이는 생쥐에서 이러한 RP 병리가 어떻게 발생하는지에 대한 우리의 이해에 기여할 수 있습니다.
이 프로토콜은 마우스의 RP 표현형을 표준화하는 데 도움이 되며, 이는 마우스 연구 결과를 다른 AMD 모델로 변환하고 AMD 병태생물학에 대한 이해를 돕습니다.
