Este protocolo é o primeiro a descrever como processar e avaliar o tamanho de camundongos para patologias do FRy usando microscopia eletrônica de transmissão de luz e microscopia confocal. A principal vantagem deste protocolo é a inclusão de avaliações quantitativas das patologias do FRy, utilizando estas três técnicas de imagem para comparações estatísticas. As técnicas descritas neste protocolo também podem ajudar a expandir nosso conhecimento de vias moleculares importantes para a saúde da EPR.
Indivíduos que não dissecaram previamente o tamanho do camundongo podem ter dificuldades com esse protocolo. Sugerimos que esses indivíduos pratiquem com alguns camundongos para dominar as técnicas descritas neste protocolo. Para começar, prepare um sistema de perfusão de alimentação por gravidade em uma almofada absorvente para perfusão cardíaca em uma capela de fumaça.
Despeje 40 mililitros de tampão fixador recém-preparado no barril da seringa do sistema de perfusão. Gire a válvula paralelamente à linha de tubulação para permitir que o buffer flua através da linha de tubulação. Lave a linha até que todas as bolhas de ar sejam removidas da linha.
Em seguida, vire a válvula perpendicularmente à linha de tubulação para impedir que o buffer flua para a linha de tubulação. Para realizar a perfusão cardíaca, transferir o camundongo eutanasiado para uma bandeja rasa próxima ao sistema de perfusão. Com o abdômen voltado para cima.
Borrife o abdômen com etanol a 70% e, em seguida, crie um corte inferior de cinco centímetros usando tesoura curva e pinça através da pele e da parede abdominal no lado esquerdo do mouse abaixo da caixa torácica. Proceder a um corte medial de três centímetros através da pele e da parede abdominal no topo do corte inferior. Faça outro corte inferior de cinco centímetros no final do corte medial através da pele e da parede abdominal no lado direito mais distante do rato, abaixo da caixa torácica.
Realizar mais incisão medial de três centímetros para retirada do retalho cutâneo abdominal com pinça curva. Em seguida, corte o diafragma e o esterno para expor o coração. Insira a agulha do calibre no ventrículo esquerdo do coração e gire a válvula.
Corte o átrio direito com tesoura curva para permitir que o sangue e o fixador saiam do coração. Deixe 10 mililitros de tampão fixador para perfundir o mouse por um a dois minutos, ou até que o fígado fique pálido e nenhum sangue flua para fora do átrio direito. Uma vez concluída a perfusão, gire a válvula perpendicularmente à linha de tubulação para interromper o fluxo tampão.
Para nuclear os olhos, retire o rato da bandeja rasa e coloque-o sobre a almofada absorvente em um exaustor. Em seguida, oriente a cabeça do mouse com o olho esquerdo voltado para o experimentador e o olho direito fora de vista. Anote o lado superior do olho com um corante de marcação de tecido.
Empurre suavemente para baixo ao redor da cavidade ocular com o polegar e o indicador para a protrusão do olho da cavidade ocular. Em seguida, usando uma tesoura curva, segure o olho com a lâmina em um ângulo de 30 graus da cavidade ocular e corte ao redor do olho. Retire o globo ocular da cabeça com pinça curva e coloque-o em uma almofada absorvente.
Corte a córnea com uma lâmina de bisturi número 11 e coloque o olho com pinça curva em um microtubo de dois mililitros contendo dois mililitros de tampão fixador. Depois de nuclear ambos os olhos, incube-os em um tampão fixador durante a noite em um agitador em uma sala de quatro graus a uma velocidade de 75 rpm. No dia seguinte, substituir o tampão fixador por dois mililitros de PBS e incubar por 10 minutos em um agitador à temperatura ambiente e 75 rpm.
Em seguida, para gerar segmentos posteriores, coloque o olho em uma placa de Petri preenchida com PBS sob um microscópio dissecante. Levante suavemente qualquer gordura e músculo para longe do globo ocular com pinças de ponta fina. Aparar cuidadosamente a gordura e o músculo com uma tesoura microdissecante em direção paralela ao globo ocular até que o globo ocular tenha uma cor preta-azulada uniforme Coloque pinças de ponta fina no local da punção corneana e corte ao redor do perímetro da córnea começando no local da punção com uma tesoura microdissecante para remover a córnea e a íris do globo ocular.
Em seguida, usando pinças de ponta fina, remova suavemente a lente do globo ocular para obter o segmento posterior. Coloque o segmento posterior em um tubo contendo dois mililitros PBS, e armazenar a quatro graus Celsius em uma geladeira até o uso. Transfira o olho para uma placa de Petri contendo PBS e remova a córnea e a íris conforme demonstrado.
Puxe a lente com pinça de ponta fina. Em seguida, com duas pinças de ponta fina, separe suavemente a retina neural do segmento posterior. Corte cuidadosamente a retina neural na cabeça do nervo óptico para remoção da taça ocular posterior.
Coloque o copo para os olhos em um microtubo de dois mililitros contendo cinco microlitros de PBS. Para fixar os óculos posteriores, adicione 500 microlitros de metanol ao tecido e incube em um agitador a 75 rpm, por cinco minutos. Repetir a fixação com metanol três vezes com incubação final por duas horas.
Após a fixação, lavar o tecido três vezes com PBS, antes de proceder à coloração por imunofluorescência e visualização por microscopia confocal. Camundongos TMEM 135 TG com quatro meses de idade mostraram uma redução significativa no epitélio pigmentado da retina ou espessura do EPR a 600 e 900 micrômetros de distância do nervo óptico, em relação aos camundongos selvagens do tipo pareados por idade. Incidentes de patologias do EPR incluindo microvascuolização, macrovacuolização e migração de camundongos WT e TMEM 135 TG com 325 dias de idade foram calculados.
A frequência média de microvacuolização por EPR foi menor no tipo selvagem em comparação com os camundongos TMEM 135 TG. Não foram detectadas macrovacuolização e migração de PSE no tipo selvagem em comparação com os valores médios observados em camundongos TMEM 135 TG. Na microscopia eletrônica de transmissão, depósitos laminares basais foram observados em retinas de 24 meses de idade que estavam ausentes em retinas de dois meses de idade.
A análise das frequências cumulativas das alturas dos depósitos laminares basais indicou um desvio para a direita da linha para os 24 meses de idade, em comparação com os dois meses de idade, demonstrando um aumento nos depósitos em camundongos de 24 meses de idade. Essa observação foi apoiada por maiores alturas médias nas retinas aos 24 meses de idade. PSE em camundongos TMEM 135 TG com quatro meses de idade foi dismórfico.
O EPR nas retinas TG TMEM 135 é maior e menos denso do que as retinas selvagens pareadas por idade. Além disso, mais células de EPR multinucleadas nas retinas TG foram observadas, em comparação com os controles. Seguindo esse protocolo, os pesquisadores puderam avaliar vias específicas usando técnicas de biologia molecular em camundongos, o que poderia contribuir para a compreensão de como essas patologias do FRy se desenvolvem em camundongos.
Esse protocolo ajudará a padronizar a fenotipagem do FR em camundongos, o que traduzirá os achados de estudos em camundongos para outros modelos de DMRI e ajudará na compreensão da patobiologia da DMRI.
