Bu protokol, canlı hayvanlarda yara iyileşmesi sırasında epitel hücrelerinin görüntülenmesini sağlar. Hücrelerin doğal karmaşık ortamlarında nasıl davrandıklarını görmemizi sağlar. Bu teknik, canlı hayvanlarda yara iyileşmesi sırasında bu reaktiflerin hücre yayılması ve göçü üzerindeki etkisini incelemek için reaktifleri hücre dışı matrise ve hücre sitoplazmasına sokar.
Epitelyal yara iyileşmesi ve Clytia, daha karmaşık hayvanlarda iyileşmeye oldukça benzer. Bu nedenle, bu sistemden yara iyileşmesinin mekanizmaları ve nasıl ortaya çıktıkları hakkında çok şey öğrenebiliriz. Bu prosedürleri gösteren Elizabeth Lee ve araştırma teknisyeni Emily Watto olacak.
Yaralama işlemine başlamak için, pipet ucunu makasla keserek, çapı yaklaşık 0,5 ila 0,7 santimetre arasında genişletilmiş bir açıklık oluşturarak modifiye edilmiş bir transfer pipeti hazırlayın. Modifiye transfer pipetini kullanarak, kurulan polip kolonilerinden toplanan medusa'yı, medusa X şemsiyesi yukarı bakacak şekilde bir çöküntü slaytına yerleştirin. Yapay deniz suyunun veya ASW'nin yeterince hayvanı kapladığından emin olun.
Hücrelerin içinde ve arasında mikro yaralar oluşturmak için, hayvanın üzerine bir örtü kayması yerleştirin. Kapak kayması mezogleayı sıkıştırır ve sıkıştırılmış dokunun geri tepmesi hücreleri hafifçe birbirinden ayırır. Oluşturulan mikro yaraları gözlemlemek için hayvanı hemen görüntüleyin.
Küçük epitel yaraları oluşturmak için, daha önce gösterildiği gibi, modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak, medusa'yı medusa X şemsiyesi yukarı bakacak şekilde bir çöküntü slaydına yerleştirin. 200 mikrolitrelik pipet ucu kullanarak medusanın yüzeyini nazikçe çizin. Hafif çizilme, bazal membranda yırtılmalara neden olabilir.
Görüntüleme için hayvanı bir kapak fişi ile örtün. Kapak kaymasının yerleştirilmesi bazen çizilmeden bile küçük epitel yaraları oluşturmak için yeterlidir. Metinde belirtilen adımları izleyerek bir mikro pipet direği ve cam kılcal tüp kullanarak bir mikroenjeksiyon iğnesi hazırlayın.
Boş mikroenjeksiyon iğnesini bir mikro manipülatöre yapıştırılmış bir mikroenjeksiyon tutucusuna yerleştirin ve iğnenin ucunu açıklık yaklaşık 20 ila 40 mikron olacak şekilde kesin. Mikroenjektör üzerindeki tutma basıncını sıfıra ve ejeksiyon basıncını inç kare başına yaklaşık 20 pound'a ayarlayın. Mikro enjektörü iki saniyelik bir hava darbesi verecek şekilde ayarlayın.
Büyük epitel yaraları oluşturmak için, medusa'yı daha önce gösterildiği gibi bir depresyon slaydına yerleştirin. Mikro manipülatörü kullanarak, mikroenjeksiyon iğne ucunu suyun hemen üzerinde kalacak şekilde ayarlayın, ucu dikkatlice suya batırın ve ardından medusa'nın epitel yüzeyine yakın olacak şekilde geri çekin. Enjektörde start tuşuna basarak havayı darbeleyin.
Ucun genişliğine bağlı olarak darbeyi aynı noktada iki ila dört kez tekrarlayın. Daha büyük uçlar daha az darbe gerektirir. Büyük yaraları görüntülemek için yaralı hayvanı bir kapak kayması ile örtün.
Netlemeyi x şemsiyesine ayarlayın. Altıgen hücreler açık olmalıdır. Görüntülemek için bir yarayı manuel olarak tanımlayın.
Görüntüleri gerçek zamanlı olarak film olarak toplayan veya düzenli aralıklarla bir dizi görüntü toplayan bir program başlatın. Yara alanının görüş alanının dışına kaymadığından ve ilgilenilen hücrelerin odakta kaldığından emin olmak için ilerlemeyi izleyin. Boya ve ilaç enjekte etmek için, metinde belirtilen adımları izleyerek bir mikroenjeksiyon iğnesi yapın.
Medusa'ya enjeksiyon için aşırı miktarda boya veya ilaç içeren uzun bir pipet ucu kullanarak mikroenjeksiyon iğnesini doldurun. Modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak, alt şemsiyesi polidimetilsiloksana veya PDMS enjeksiyon kabına bakacak şekilde, hayvanı örtecek kadar ASW olacak şekilde bir medusa yerleştirin. Çanağı diseksiyon mikroskobunun bir aşamasına yerleştirin.
Mikroenjeksiyon iğne ucuna odaklanın ve medusanın yakınındaki suya ilerletin. Mikro manipülatör ile, iğneyi bükülene ve kırılana kadar kabın içine bastırın. Yaklaşık 10 ila 20 mikronluk bir uç açıklığı oluşturur.
Mikro manipülatörü kullanarak, X şemsiyesini delmeden iğnenin ucunu alt şemsiyeden mezogleaya yerleştirin. Mikroenjektörde, tutma basıncını sıfıra ve enjeksiyon basıncını inç kare başına 20 pound'un altına veya buna eşit olarak ayarlayın. Bir veya iki kadrana enjekte edin, her birini bir boya lekesi veya ilaçla doldurun, kabaca o çeyreğin alanının dörtte biri kadar.
Hangi boya veya ilacın enjekte edildiğine bağlı olarak, hayvanlar boya veya ilaç difüzyonu ve inkübasyonuna izin vermek için taze ASW kabına yerleştirilir. Görüntüleme için, modifiye edilmiş bir transfer pipeti kullanarak medusa'yı bir çöküntü slaydına monte edin ve hayvanı X şemsiyesi yukarı bakacak şekilde konumlandırın. Enjekte edilen bir reaktifin etkisini test etmek için hayvanlar bu aşamada yaralanabilir.
Hücrelerin içindeki ve arasındaki mikro yaralar, yara kapanması sırasında küçük lamellipodia oluşturdu. Bunu kasılma izledi ve yaralar bir dakikadan kısa sürede iyileşti. Küçük epitel yaraları da lamellipodia oluşumu ve lamellipodia kontaklarının uzaması yoluyla iyileşti.
Hızlı ve ilerleyici yara kapanması, yeni oluşan yara dikişi boyunca doku kasılmasından önce ortaya çıktı. Toplam yara alanının zaman içindeki yüzdesi olarak ifade edilen iki küçük yaranın normalleştirilmiş iyileşme hızı, yara kapanma dinamiklerinde bir miktar değişkenlik gösterdi. Tedavi edilmeyen hayvanlarda ortalama bir yara iyileşme eğrisi oluşturmak için 14 farklı yaradan elde edilen veriler kullanılmıştır.
Bazal membran hasarı olan küçük bir yarada, marjinal hücreler hasarlı bölgenin etrafına yayılır ve boşluk bir kese ipi kasılması ile kapanır. Doku susuz kaldığında veya tamir edilemeyecek kadar hasar gördüğünde, hücre hareketleri durabilir veya tüm hücre tabakası patlayabilir. Büyük yaralar birkaç aşamada iyileşti.
Kenardaki kasılmaları, lamellipodia oluşumunu ve lamellipodia'nın genişlemesini takiben kenarın yumuşatılması, kolektif hücre göçüne ve marjdan birkaç hücre katmanına temas eder, marj büyük boşlukları kapatır. Nükleer ve membran boyama, reaktiflerin ECM'ye mikroenjekte edilmesiyle sağlandı. Sitokalasin B'nin mikroenjeksiyonu, yaralanma sonrası lamellipodia oluşumunu inhibe etti.
Hayvanları nazikçe tutun. Reaktifleri enjekte ederken, mikroenjeksiyon iğnesinin ucunun mezogleada olduğundan ve hayvanın içinden geçmediğinden emin olun. Şu anda, transgenik hayvanlar floresan etiket proteinleri ile yapılmaktadır, kombine floresan ve diferansiyel müdahale edici kontrast mikroskopisi, epitel yara iyileşmesindeki hücresel olayların daha net bir görüntüsünü verecektir.
