Bu çalışmada kullanılan fare modeli, insanlarda epitelyal mezenkimal geçiş yoluyla kronik nikotin alımının ve tekrar tekrar silikaya maruz kalmanın akciğer fibrozları üzerindeki etkisini etkili bir şekilde simüle etmektedir. Jüri porsiyon modeli, basit ve güvenilir bir şekilde deri altı nikotin enjeksiyonu ve silika burun damlası ile elde edildi. Litre başına 20 miligramlık bir süspansiyon hazırlamak için steril kristal silikayı tuzlu su içinde askıya alın.
25 dakika boyunca ultrasonik çalkalama su banyosunda salın. Silika süspansiyonu üç dakika boyunca bir girdap osilatörü ile yerleştirin. Karıştırmak için süspansiyonu aspire edin ve ardından burun damlası için 50 mikrolitre kullanın.
Silika maruziyetine başlamak için önce anestezi uygulanmış fareyi bir elin avucuna yerleştirin ve farenin burun boşluğunu ortaya çıkarın. Bir burun deliğinden dört ila sekiz saniye içinde 50 mikrolitre silika süspansiyonu enjekte edin. Süspansiyonun hızlı bir şekilde akciğere nüfuz etmesini sağlamak için, farenin göğsüne işaret parmağıyla üç ila beş saniye hafifçe bastırın, solunum hızını korumak için her saniye üç ila beş kez basın.
Fare düzgün solunum gösterdiğinde, üç dakika boyunca bir kafeste gözlem altına alın. Bir mililitrelik şırıngaya 0.2 mililitre işaretine kadar hava çekerek nikotin şırıngaları hazırlayın. Ardından, 125 mikrolitre nikotin hazırlayın.
İğneyi ve ön ucunu nikotinle doldurmak için şırıngaya dokunun ve ardından ışıktan korunan bir tepsiye yerleştirin. Sağ elinizle farenin kuyruğunu kavrayın. Fare rahatladığında, kuyruktan kulağın kenarına kadar cilde orta derecede baskı uygulamak için sol başparmağınızı ve işaret parmağınızı kullanın.
Şimdi sağ elinizi bırakın ve fareyi hareketsiz hale getirmek için kuyruğu ve arka bacakları sıkıştırmak için sol, küçük ve yüzük parmaklarını kullanın. Enjeksiyon şırıngasını sağ elinizde tutun ve boynun arkasındaki cildi baştan kuyruğa doğru delin. Nikotini tek tip bir oranda enjekte edin.
Anestezi uygulanmış fareyi bir köpük test plakasına sabitleyin ve kürkü% 75 alkol püskürtün. Göğüs boşluğunu açığa çıkaran karnın orta hattı boyunca bir kesi yapın. Kalbin sağ tarafının tepesinde küçük bir kesi yapın.
20 mililitre önceden soğutulmuş PBS'yi sol kalbin tepesinden yavaşça ve düzgün bir şekilde enjekte edin, bu da kanın sağ kalbin tepesinde oluşturulan açıklıktan dışarı akmasına neden olur. Tüm akciğer lobunu çıkarın ve eksi 80 santigrat derecede soğutun. Kalan fareleri 10 mililitre% 4 para-formaldehit ile perfüze edin.
PBS perfüzyonundan sonra, akciğerleri 30 mililitre para-formaldehit çözeltisinde koruyun. 72 saat sonra, akciğerleri hazırlanan fiksatife daldırın ve ultrasonik su banyosuna yerleştirin. 40 santigrat derecede 30 dakika temperlenir.
Daha sonra, dokuyu %75 etanole, ardından %95 etanole ve ardından her biri 50 dakika susuz etanole yerleştirerek dehidrasyon gerçekleştirin. Dokuyu yıkamak için akciğer dokusunu iki kez 50 dakika ksilene batırın. Dokuyu 55 ila 60 santigrat derecede iki ila üç saat boyunca erimiş parafin mumuna yerleştirin.
Balmumu sertleştikten sonra, dört ila beş mikrometre kalınlığındaki akciğer dilimlerini elde etmek için bir kesit alma makinesi kullanın. Bölümleri ultra saf suda 45 santigrat derecede ısıtın. Balmumu eridikten sonra akciğer bölümlerini yapışık bir mikroskop lamına yerleştirin.
Hematoksilen ve eozin boyama çalışmaları, silika ile birlikte nikotine maruz kalan farelerin, tek başına nikotin veya silikaya maruz kalanlara göre önemli ölçüde daha ciddi akciğer hasarına sahip olduğunu göstermiştir. Masson'un boyanması, diğer gruplara göre nikotin silika kombinasyonuna maruz kalan akciğerlerde artmış kollajen lifi birikimini ortaya çıkardı. Silikaya maruz kalan farelerde alveolar yapılar tahrip edildi.
İmmünohistokimyasal çalışmalar, nikotin ve silika kombinasyonuna maruz kalan farelerde artmış CD iki sıfır altı pozitif makrofajlar ve pro-fibrotik faktör, TGF beta bir pozitif hücreler ortaya çıkardı. Vimentin ekspresyonu, diğer gruplara göre ikili ekspresyona maruz kalan farelerde daha yüksekti. İmmünohistokimyasal çalışmalar ve protein ölçümü ciddi epitelyal mezenkimal transformasyon düşündürmektedir.
Başarılı bir nikotin enjeksiyonu sağlamak için, operatörün fareleri kavramaya aşina olması gerekir, çünkü boynun arkasındaki cildi kavramak onlar için acı verici olabilir.
