Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (AM), ABD Savunma Bakanlığı (BC074986), Boston Çocuk Hastanesi Fakültesi Kariyer Geliştirme Bursu (TM, AM) fonları tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, teknik yardım için Amanda Jiang ve Elisabeth Jiang teşekkür ederiz.

NOT: in vivo hayvan çalışması Ulusal Sağlık Enstitüleri Laboratuvar Hayvanları Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu önerileri ile tam uyum içinde yürütülmüştür. protokol gözden ve Boston Çocuk Hastanesi Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (Protokol Numaraları: 13-10-2526R, 14-02-2568R) tarafından onaylandı. Bu protokolde kullanılan tüm ilaçlar, farmasötik dereceli olan ve bu ilaçlar, steril koşullar altında hazırlanır. 1. fibrin jel çözeltisi, <ol><li> VEGF ve bFGF içeren fibrin jel hazırlayın. <ol><li> Oda sıcaklığına kadar -80 ° C (25 ° C) saklanır fibrinojen ve trombin çözülme stok çözeltileri. </li><li> Fıbrinojene: (0-100 ng / ml nihai konsantrasyon), CaCl2 (nihai konsantrasyon: 45 mM), VEGF (nihai konsantrasyon 0-100 ng / ml) ve bFGF: trombin (2.5 U / ml nihai konsantrasyon) ilave çözeltisi (nihai konsantrasyon:% 0.9 sodiu içinde 12.5 mg / mlm 1,5 ml tüp klorür solüsyonu 43-45). </li><li> Pipetleme tarafından yavaşça karıştırın. </li><li> Yavaşça P200 pipet kullanarak damla damla steril bir plastik tabak üzerine karışımın 200 ul pipetle. </li><li> Katılaşma kadar, 30-60 dakika boyunca, 37 ° C&#39;de damla inkübe edin. Not: katılaşmış jel implantasyon (Şekil 1a) önce bir kaç saat için oda sıcaklığında (25 ° C) &#39;de kapalı bir plastik tabak içinde tutulabilir. </li></ol></li><li> Implantasyon öncesi küçük cerrahi makas kullanarak yaklaşık 3 x 3 x 3 mm küpler halinde fibrin jel Trim. </li></ol> 2. Fare Hazırlama <ol><li> Intraperitoneal ketamin ile (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) (IP) enjeksiyon yetişkin fare (8-12 hafta) uyutmak ve fare yeterince fare burnunu sıkıştırarak anestezi onaylayın. <ol><li> Deney sırasında kuruluğunu önlemek için fare gözleri veteriner merhem kullanın. </li></ol></li><li> Tıraş fufare göğüs kafesinin sol tarafında üzerinde r. </li><li> Fare endotrakeal entübasyon gerçekleştirin. </li><li> Entübasyon fare 70 ° açılı standı ve standın üst kısmında bulunan küçük bir lastik bant üzerinde üst kesicilerin çengel yerinde fareyi tutun yerleştirin. </li><li> Yavaşça künt forseps kullanarak bir tarafa dilini geri çekin. </li><li> Bir fiber-optik mikroskop boynu ışığı yardımı ile gırtlak gözünüzde canlandırın. </li><li> Trakea içine endotrakeal elastik kateter (21 G) yerleştirin. </li><li> Fare kendiliğinden (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) sorunsuz bir biçimde nefes olduğunu doğrulayın. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında yüzüstü pozisyonda fare yerleştirin. </li><li> Mekanik bir kemirgen vantilatör kullanarak fare havalandırın (150 solunum / dk ve 7 ml / kg tidal hacmi). </li><li> 4. ve 5. kaburga arasındaki interkostal boşluk bulmak için kaburga sayın. </li><li> Alan b üzerinde steril bir alan oluşturuny iyice alkol ve Povidon-İyot ile silerek. Steril cerrahi örtü ile yeterince cerrahi alan örtün. </li></ol> 3. Fare Cerrahisi <ol><li> Deri içinde% 0.25 bupivakain (200 ul), lokal enjeksiyonundan sonra, kesme makasları kullanılarak interkostal aralığa boyunca enine cilt insizyonu (yaklaşık 1 cm uzunluğu) sunuyor. </li><li> Interkostal kas içine% 0.25 bupivakain (200 ul) enjeksiyonundan sonra, ince, küçük makas kullanarak 4. ve 5. kaburga arasında bir kas kesi yapmak. </li><li> Tam sol akciğer görselleştirmek için kaburga arasında bir diseksiyon retraktör yerleştirin. <ol><li> Ince forseps kullanılarak sol akciğer merkezinin viseral plevra küçük bir alanda (1 x 1 mm kare) Pençe. </li><li> Kanama ve hava kaçakları tamamen kontrol kadar steril bir pamuklu çubukla kullanarak alanda hafif basınç uygulayın. </li><li> Fibrinojen / trombin (fibrin yapıştırıcı) taze karışımı (adım 1.1.2. 20 &amp; # az miktarda koyun181; P200 pipet kullanarak alana l). </li></ol></li><li> Yavaşça alanı (Şekil 1b) üzerinde küçük forseps kullanarak bir fibrin jel (adım 1.2) yerleştirin. <ol><li> Jel de akciğer solunum hareketleri sırasında bölgede sabit olduğunu doğrulayın. </li></ol></li><li> Ne masif hava sızıntı veya akciğer kanaması olduğundan emin olun. </li><li> Bulunmamaktadır absorbe edilebilir sütür ile yakın insizyon (kas ve deri tabakaları) bertaraf edilmesi. </li><li> Pnömotoraks önlemek için 27 G iğne ile 1 ml şırınga kullanarak göğüs boşluğu aspire. </li><li> Mekanik ventilasyon sonlandırın. </li></ol> 4. Fare Kurtarma <ol><li> Fare kendiliğinden düzgün bir şekilde (normal 100-150 solunum / dk, hiçbir paradoksal veya sığ solunum) nefes emin olun. </li><li> IP 1 ml enjekte dehidratasyonu önlemek için NaCl% 0.9 önceden ısıtılmış. </li><li> Fare dolaşan sıcak su yastığı üzerinde kurtarmak için izin verin. </li><li> Endotrache kaldırFare istikrarlı nefes olduğunu onayladıktan sonra al tüpü. </li><li> Ameliyat sonrası ağrı kesici olarak 3 gün boyunca, meloksikam (5 mg / kg, deri altına enjeksiyon (SC) enjekte edilir. </li><li> O (kendi mide üzerine rulo mümkün ve dik kalması) sternum ve bilinçli kadar dikkatlice 15 dakika aralıklarla en az fare hareketlerini izlemek. </li><li> İyileştikten sonra, ameliyat olmadan farelerden izole bir yeni kafes fare dönün. </li><li> Günlük aşağıdaki enfeksiyon belirtileri (kızarıklık, şişme, akıntı), hayvanın temel biyolojik fonksiyonları (gıda ve su alımı, idrar, dışkılama, vücut ağırlığı artışı) yanı sıra klinik belirtileri sıkıntı cerrahi sitesini (piloerection, azaltılmış hareket) Monitör cerrahi prosedür. </li></ol> 5. Hasat Akciğer <ol><li> 7-30 gün implantasyondan sonra, sıkıştırılmış gazın kaynağı ile CO2 kullanılarak fare euthanize. </li><li> Xiphoid sürecin ucu ve Sternum arasında bir kesi yapmakçentik (medyan sternotomi) ve trakea kesme ve kalp, akciğerler, trakea tüm bağlantıları keserek histolojik ve biyokimyasal analiz için implante jel ile hasat tüm akciğer. </li><li> Gecede Ekim bileşik embed 4 ºC,% 4 paraformaldehit çözeltisi ile akciğer ile implante jel Fix ve 30 mikron kalınlığında seri adımı bölümlerini almak. </li><li> Histolojik (hematoksilen ve eozin boyama) ve immünohistokimyasal analizler gerçekleştirin (endotel işaretleyici: CD31, epitel işaretleyici: aquaporin (AQP) 5 ve surfaktan protein (SP) -B) konfokal mikroskop 22,37,40 kullanarak. </li><li> 3D görüntü analiz yazılımı kullanarak 37 akciğer endotel üç boyutlu görüntüler ve epitel hücreleri oluşturmak için optik bölümler (kalın 30 mikron) yığınlarını derleyin. </li><li> Görüntü analiz yazılımı 46 kullanılarak yeni oluşan kan damarlarının öngörülen alanları gösteren alanlardır. </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

Bu makalede, erişkin fare yaşayan akciğer yüzeyinde biyomalzemeleri implant için yeni bir yöntem tanıttı. Bu sistem ile, ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men başarılı bir malzeme içinde değinmeyecek. Bu sistem, araştırmacılar, endotel hücreleri arasındaki karışma keşfetmek sağlar, diğer hücrelerin (örneğin, epitelyal hücreler, mezenkimal hücreler, bağışıklık hücreleri) yerel anjiyojenez 50-53 ve alveolar rejenerasyon 24,54 için gerekli olan ve ECM ...

Bu protokolün genel amacı araştırmacılar, akciğer vasküler ve alveol gelişme moleküler mekanizmaları karakterize sağlar erişkin fare, akciğer yüzeyinde fibrin jel implant için bir yöntem tanıtmak ve yetenekli biyomimetik malzemelerin geliştirilmesi için bu bilgiyi kaldıraç için çeşitli akciğer hastalıkları tedavi etmek için fizyolojik akciğer vasküler ve alveol oluşumunu yansıtan bir. 35 milyondan fazla Amerikalı kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve pulmoner fibrozis gibi kronik akciğer hastalıkları muzdarip. Bu hastalar önemli ölçüde günlük yaşam 1-3 bozan tür nefes darlığı, göğüste sıkışma hissi, öksürük nagging ve yorgunluk gibi uzun ömürlü kronik solunum semptomları var. Bu akciğer hastalıkları için etkili tedaviler geliştirmek için çaba büyük bir miktarda rağmen, şu anda tedavisi yoktur; Bu nedenle, bu hastalarda yaşam kalitesi zayıf ve ekonomik ve insani maliyeti merhaba vardırgh 4-7. Şu anda, akciğer transplantasyonu son dönem kronik akciğer hastalığı olan hastaları kurtarmak için tek yoldur. Ancak, nakli donör, yüksek maliyet, ciddi komplikasyonlar ve düşük sağkalım oranı 8-11 sıkıntısı, transplantasyon optimal yaklaşım değildir. Doku mühendisliği teknikleri son hızla ilerleme progenitör hücreleri veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerden 12,13 çeşitli tipleri ile decellularized bütün akciğeri repopulating tarafından implante akciğer biyomühendis araştırmacıların sağladı. Bununla birlikte, bu bulasıcı akciğerler sadece implantasyon 12,14,15 sonra birkaç saat süre ile bir ev sahibi, hayvanlarda işlevsel. Akciğerlerin karmaşık yapıları ve işlevleri yenilenmesine biomateryaller kullanmak da oldukça başarısız olmuştur. Erişkin akciğer rejenerasyon yöneten kilit biyolojik süreçler iyi araştırılmış değil çünkü bu olabilir. Akciğerde vasküler sistemin oluşumu erken ve en önemli olaylarından biri olan During geliştirme ve yenilenme 16-21. Yeni, sadece oksijen, besin ve organ oluşumu için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri teslim değil, aynı zamanda çevredeki hücrelere 22-25 öğretici düzenleyici sinyallerini sağlamaz akciğerde vaskülatürlerden kurdu. Böylece, anjiyogenez yetişkin akciğerlerde 24,26,27 rejeneratif alveolarization kilit roller oynar. Buna ek olarak, düzensiz anjiyogenez, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (KOAH), 28, bronkopulmoner displazi (SKB), 21-23, ve pulmoner fibroz 29 gibi kronik akciğer hastalıklarına katkıda bulunur. Böylece, akciğerleri mühendislik veya kronik akciğer hastalıklarının tedavisi için daha etkili stratejiler geliştirmek, akciğer özel anjiyogenez temel mekanizmalarını anlamak için gereklidir. Her organ fizyolojik ve patolojik durumlarda 30-33 arasında farklılık benzersiz mekanik ve kimyasal özelliklere gösterir. Bu organa özgü microenvironrından endotel hücre davranışlarını düzenleyen ve bir organ-spesifik şekilde 24,34-36 vasküler ağı oluşumu sonucu alacak. Böylece, akciğer rejenerasyonu için daha etkin stratejilerin geliştirilmesi için, akciğer özgü angiogenesisi altında yatan mekanizmanın anlaşılması gerekir. Subkutan hidrojel implantasyonu gibi in vivo geleneksel anjiyojenez tahlilleri anjiyogenez araştırma 37-39 için yaygın olarak kullanılmış olmasına rağmen, bu yöntemler, organa özgü anjiyojenezi özetlemek yoktur. Son zamanlarda, fare akciğer elastik kalıp içinde Matrigel implant için yeni bir yöntem geliştirilmiştir ve başarılı bir jel 22, kan damarları ve akciğer epitelyal hücreleri iyileştirme gösterilmiştir. Bu eşsiz bir yaklaşım araştırmacılar fizyolojik ve patolojik durumlarda, kan damarları ve vasküler olmayan akciğer hücreleri arasında akciğer özgü anjiyojenezin mekanizması olarak etkileşimleri keşfetmek için izin verir. 1) Matrigel klinik uygulama için uygun olmadığı; 2) EBir klinik olarak daha uygun bir yaklaşım olarak, hidrojeller ve ev sahibi akciğer dokusunda ve 3) akciğer elastik kalıp potansiyel solunum sırasında akciğer fonksiyonu ve ağrı gibi yakınmalara yol açar arasındaki etkileşimi etkileyebilir jel döküm için kullanılan Lastic kalıp, bir 3D fibrin matriks anjiogenik faktörleri içeren (vasküler endotel büyüme faktörü (VEGF) / temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF)) elastik kalıp döküm olmaksızın fare akciğer implante edilmiş ve başarılı bir şekilde ana akciğer türetilmiş angiogenesisi değinmeyecek olmuştur. Fibrin jel, trombinle ayrılmış fibrinojenden oluşan polimer fibriller yakalamak için in vivo 40,41 anjiyojenezi hızlandırmak için örneğin bFGF ve VEGF gibi anjiyojenik faktörlerin bir çeşitliliği bilinmektedir. Çünkü onun rejeneratif yeteneği ve biyobozunur doğa 42, fibrin jel yaygın doku mühendisliği alanında kullanılır. Bu makalede yaşayan Adul akciğer yüzeyinde fibrin jel implant bir roman ve benzersiz bir yaklaşım tanıttıt, fare ve ana akciğer elde edilmiş angiogenesis men in vivo jellerin içinde özetlenen olduğunu göstermektedir. Akciğer özel anjiyogenez çalışma araştırmacılar sağlayan bu yöntem, büyük olasılıkla akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımlarının gelişmesine yol ve anlamlı başarıyla yetişkin akciğeri yeniden çabalarını ilerleyecektir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="956">
	<tbody>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:177px;">Company</td>
			<td style="width:147px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:289px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fibrinogen from human placenta</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F4883</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Thrombin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T9549</td>
			<td>For fabrication of fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse VEGF 164</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>493-MV</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Recombinant mouse bFGF</td>
			<td>R&#38;D</td>
			<td>3139-FB</td>
			<td>For supplementation to fibrin gel</td>
		</tr>
		<tr height="48">
			<td height="48" style="height:48px;width:343px;">Rodent Intubation Stand</td>
			<td style="width:177px;">Braintree Scientific INC</td>
			<td style="width:147px;">RIS 100</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Fiber-Optic Light Source</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-565-35</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">20G Elastic catheter</td>
			<td>B.Braun</td>
			<td>4251652-02</td>
			<td>For intubation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:343px;">MiniVent Ventilator</td>
			<td style="width:177px;">Harvard Apparatus</td>
			<td style="width:147px;">CGS-8009</td>
			<td>For ventilation</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Stemi DV4 Steromicroscope</td>
			<td style="width:177px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12-070-515</td>
			<td>For surgey</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Absobable suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td>PDP304</td>
			<td>Surgical suture</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against CD31</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td align="right">553370</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against AQP5</td>
			<td style="width:177px;">Abcam</td>
			<td>AB78486</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Antibody against SP-B</td>
			<td style="width:177px;">Millipore</td>
			<td>AB40876</td>
			<td>Immunohistochemistry</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

Kök hücre araştırma ve biyomühendislik tekniklerinden son önemli gelişmeler yeniden ve ortopedik ve periodontal alanlarda basit dokularda hasarı onarmak için biomateryaller kullanan büyük ilerleme kaydettik. Organ yenilenmesi biyolojik süreçleri iyi araştırılmış değil çünkü Ancak, yapılar ve akciğer gibi daha karmaşık üç boyutlu (3D) organların işlevlerini yeniden çalışır çok başarılı olmamıştır. Angiogenesisin, yeni kan damarlarının oluşumu, organ yenilenmesi kilit rol oynadığı açık hale gelmektedir. Yeni vaskülatürlerden oksijen, besinler ve organ yenilenmesi için gerekli olan çeşitli hücre bileşenleri sunmak değil, aynı zamanda rejenere dokularda lokal bir öğretici sinyallerini sağlamaz olarak, oluşturulmuş. Bu nedenle, başarılı bir yetişkinde akciğerlere yeniden oluşturmak, lokal, akciğer dokularının sürücüler rejenerasyonu angiogenesis olan akciğer özgü mikroçevrelerde özetlemek için gereklidir. Co rağmennventional, in vivo bu hidrojeller (örneğin, fibrin ve kollajen jelleri veya Matrigel - Engelbreth-Holm-Swarm fare sarkom hücreleri tarafından salgılanan ECM proteini karışımı) bakımından zengin hücre dışı matrisin (ECM), deri altından implante anjiyojenez tahlilleri, yoğun keşfetmek için kullanılır akciğer biyomateryaller ortotopik implantasyonu için yöntemler iyi tespit edilmemiştir çünkü anjiyojenez genel mekanizma, akciğer spesifik anjiyojenez iyi karakterize edilmemiştir. Bu protokolün amacı jel içinde ev sahibi akciğer kaynaklı anjiyogenez başarılı recapitulation sağlayan, yaşam yetişkin fare akciğer yüzeyinde fibrin jel implant benzersiz bir yöntem tanıtmaktır. Bu yaklaşım, akciğer özgü mikroçevresinin, normal ve patolojik durumlarda hem anjiyogenez ve alveol yenilenmesini kontrol eden mekanizmalar keşfetmek için araştırmacılar sağlar. Implante biyomalzemeler sunulduğundan beri komşu l fiziksel ve kimyasal sinyalleri tedarik veung dokular, hastalıklı akciğer bu biyomalzeme implantasyonu potansiyel akciğer hastalıkları çeşitli türleri için yeni tedavi yaklaşımları geliştirmek için araştırmacılar sağlayan, komşu hastalıklı dokuları normale olabilir.

Ana akciğer türevi damar oluşumu, akciğer implante biyomalzeme içinde özetlenen olup olmadığını incelemek için, fibrin jel büyük anjiyojenik faktörler VEGF ve bFGF ile desteklenmiş (0, 10 ve 100 ng / ml her biri) gibi canlı fare akciğer yüzeyine yerleştirildi Matrigel 22 kullanılarak bildirdi. Şekil 1a gösterildiği gibi bu anjiyojenik büyüme faktörleri içerir fibrin jeller 47 imal edildi. Torakotomi sonra, sol akciğer yüzeyinde küçük bir alanda forse...

Watch this Scientific Journal Video about Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis at JoVE.com

Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

Fare Akciğer Fibrin Gel implantasyonu Akciğer özel Anjiogenez Eğitim için

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K Görüntüleme.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

Video: Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

A Mouse Model of the Cornea Pocket Assay for Angiogenesis Study

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are administered 1. This uniqueness has made the cornea pocket assay one of the most used models for angiogenesis studies. The cornea composes multiple layers of cells. It is therefore possible to embed a pellet containing the angiogenic factor of interest in the cornea to investigate its angiogenic effect 2,3. Here, we provide a step by step demonstration of how to (I) produce the angiogenic factor-containing pellet (II) embed the pellet into the cornea (III) analyze the angiogenesis induced by the angiogenic factor of interest. Since the basic fibroblast growth factor (bFGF) is known as one of the most potent angiogenic factors 4, it is used here to induce angiogenesis in the cornea.

The cornea is unique in that it lacks vascular tissues. However, robust blood vessel growth and survival can be induced in the cornea by potent angiogenic factors. Therefore, the cornea can provide with us a valuable tool for angiogenic studies. This protocol demonstrates how to perform the mouse model of cornea pocket assay and how to assess the angiogenesis induced by angiogenic factors using this model.

Anjiyogenez Çalışması Kornea Cep Testi Fare Modeli

A normal cornea is clear of vascular tissues. However, blood vessels can be induced to grow and survive in the cornea when potent angiogenic factors are ...

Tıp

Treatment of Osteochondral Defects in the Rabbit's Knee Joint by Implantation of Allogeneic Mesenchymal Stem Cells in Fibrin Clots

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular cartilage and subchondral bone in recent years led to increased attention to restoration of the entire osteochondral unit. In comparison to chondral lesions the regeneration of osteochondral defects is much more complex and a far greater surgical and therapeutic challenge. The damaged tissue does not only include the superficial cartilage layer but also the subchondral bone. For deep, osteochondral damage, as it occurs for example with osteochondrosis dissecans, the full thickness of the defect needs to be replaced to restore the joint surface 1. Eligible therapeutic procedures have to consider these two different tissues with their different intrinsic healing potential 2. In the last decades, several surgical treatment options have emerged and have already been clinically established 3-6.
Autologous or allogeneic osteochondral transplants consist of articular cartilage and subchondral bone and allow the replacement of the entire osteochondral unit. The defects are filled with cylindrical osteochondral grafts that aim to provide a congruent hyaline cartilage covered surface 3,7,8. Disadvantages are the limited amount of available grafts, donor site morbidity (for autologous transplants) and the incongruence of the surface; thereby the application of this method is especially limited for large defects.
New approaches in the field of tissue engineering opened up promising possibilities for regenerative osteochondral therapy. The implantation of autologous chondrocytes marked the first cell based biological approach for the treatment of full-thickness cartilage lesions and is now worldwide established with good clinical results even 10 to 20 years after implantation 9,10. However, to date, this technique is not suitable for the treatment of all types of lesions such as deep defects involving the subchondral bone 11.
The sandwich-technique combines bone grafting with current approaches in Tissue Engineering 5,6. This combination seems to be able to overcome the limitations seen in osteochondral grafts alone. After autologous bone grafting to the subchondral defect area, a membrane seeded with autologous chondrocytes is sutured above and facilitates to match the topology of the graft with the injured site. Of course, the previous bone reconstruction needs additional surgical time and often even an additional surgery. Moreover, to date, long-term data is missing 12.
Tissue Engineering without additional bone grafting aims to restore the complex structure and properties of native articular cartilage by chondrogenic and osteogenic potential of the transplanted cells. However, again, it is usually only the cartilage tissue that is more or less regenerated. Additional osteochondral damage needs a specific further treatment. In order to achieve a regeneration of the multilayered structure of osteochondral defects, three-dimensional tissue engineered products seeded with autologous/allogeneic cells might provide a good regeneration capacity 11.
Beside autologous chondrocytes, mesenchymal stem cells (MSC) seem to be an attractive alternative for the development of a full-thickness cartilage tissue. In numerous preclinical in vitro and in vivo studies, mesenchymal stem cells have displayed excellent tissue regeneration potential 13,14. The important advantage of mesenchymal stem cells especially for the treatment of osteochondral defects is that they have the capacity to differentiate in osteocytes as well as chondrocytes. Therefore, they potentially allow a multilayered regeneration of the defect.
In recent years, several scaffolds with osteochondral regenerative potential have therefore been developed and evaluated with promising preliminary results 1,15-18. Furthermore, fibrin glue as a cell carrier became one of the preferred techniques in experimental cartilage repair and has already successfully been used in several animal studies 19-21 and even first human trials 22.
The following protocol will demonstrate an experimental technique for isolating mesenchymal stem cells from a rabbit's bone marrow, for subsequent proliferation in cell culture and for preparing a standardized in vitro-model for fibrin-cell-clots. Finally, a technique for the implantation of pre-established fibrin-cell-clots into artificial osteochondral defects of the rabbit's knee joint will be described.

An experimental technique for the treatment of osteochondral defects in the rabbit's knee joint is described. The implantation of allogeneic mesenchymal stem cells into osteochondral defects provides a promising development in the field of tissue engineering. The preparation of fibrin-cell-clots in vitro offers a standardized method for implantation.

Fibrin pıhtısı içinde allojenik Mezenkimal Kök Hücre implantasyonu ile Tavşan Diz Eklemi içinde Osteokondral Kusur tedavisi

The treatment of osteochondral articular defects has been challenging physicians for many years. The better understanding of interactions of articular ...

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

İskemik Sıçan Akciğer Angiogenezis

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Fare Akciğer Entübasyonun Basit Bir Yöntem

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. With the increasing availability of knockout and transgenic derivatives, together with a vast amount of genetic information, mice provide one of the best models to study the molecular mechanisms underlying the pathology and physiology of lung diseases. Inhalation, intranasal instillation, intratracheal instillation, and intratracheal intubation are the most widely used techniques by a number of investigators to administer materials of interest to mouse lungs. There are pros and cons for each technique depending on the goals of a study. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented. This technique was applied to administer bleomycin to mouse lungs as a model to study pulmonary fibrosis.

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular disease and for developing therapeutic intervention. Here a noninvasive intratracheal intubation method that can directly deliver exogenous materials to mouse lungs is presented.

Noninvaziv Entübasyon Fare Akciğer Patolojisi ve Fizyolojisi Eğitim için

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

Retinal Detachment Model in Rodents by Subretinal Injection of Sodium Hyaluronate

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the occurrence of subretinal hemorrhage can affect photoreceptor cell death in the detached retina. Hence, it is advantageous to create reproducible RDs without subretinal hemorrhage for evaluating photoreceptor cell death. We modified a previously reported method to create bullous and persistent RDs in a reproducible location with rare occurrence of subretinal hemorrhage. The critical step of this modified method is the creation of a self-sealing scleral incision, which can prevent leakage of sodium hyaluronate after injection into the subretinal space. To make the self-sealing scleral incision, a scleral tunnel is created, followed by scleral penetration into the choroid with a 30 G needle. Although choroidal hemorrhage may occur during this step, astriction with a surgical spear reduces the rate of choroidal hemorrhage. This method allows a more reproducible and reliable model of photoreceptor death in diseases that involve RD such as rhegmatogenous RD, retinopathy of prematurity, diabetic retinopathy, central serous chorioretinopathy, and age-related macular degeneration (AMD).

Creating experimental retinal detachments with a reproducible and sustained height of detachment, and without subretinal hemorrhage, is important for studying the pathophysiology of photoreceptor cell loss in retinal disease and evaluating potential therapeutic interventions. Here, we report such a method in detail.

Sodyum Hyaluronat subretinal Enjeksiyon Kemirgenler Retina Dekolmanı Modeli

Subretinal injection of sodium hyaluronate is a widely accepted method of inducing retinal detachment (RD). However, the height and duration of RD or the ...

Intubation-mediated Intratracheal (IMIT) Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences between the murine and human respiratory systems, especially in their upper respiratory tracts (URT). In some models, these differences in the murine nasal cavity can have a significant impact on disease progression and presentation in the lower respiratory tract (LRT) when using intranasal instillation techniques, potentially limiting the usefulness of the mouse model to study these diseases. For these reasons, it would be advantageous to develop a technique to instill bacteria directly into the mouse lungs in order to study LRT disease in the absence of involvement of the URT. We have termed this lung specific delivery technique intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation. This noninvasive technique minimizes the potential for instillation into the bloodstream, which can occur during more invasive traditional surgical intratracheal infection approaches, and limits the possibility of incidental digestive tract delivery. IMIT is a two-step process in which mice are first intubated, with an intermediate step to ensure correct catheter placement into the trachea, followed by insertion of a blunt needle into the catheter to mediate direct delivery of bacteria into the lung. This approach facilitates a &#62;98% efficacy of delivery into the lungs with excellent distribution of reagent throughout the lung. Thus, IMIT represents a novel approach to study LRT disease and therapeutic delivery directly into the lung, improving upon the ability to use mice as surrogates to study human respiratory disease. Furthermore, the accuracy and reproducibility of this delivery system also makes it amenable to Good Laboratory Practice Standards (GLPS), as well as delivery of a wide range of reagents which require high efficiency delivery to the lung.

Intubation-mediated Intratracheal IMIT Instillation: A Noninvasive, Lung-specific Delivery System

Intubation-mediated intratracheal (IMIT) instillation of reagents is an excellent, noninvasive method for studying respiratory disease, as well as a method for instilling therapeutic reagents directly into the lung. It is a rapid and highly reproducible method which is suitable for preclinical testing.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Respiratory disease studies typically involve the use of murine models as surrogate systems. However, there are significant physiologic differences ...

Mouse Pneumonectomy Model of Compensatory Lung Growth

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to disability or death. Injury-based animal models of lung repair and regeneration are limited by injury-specific responses making it difficult to differentiate changes related to the injury response and injury resolution from changes related to lung repair and lung regeneration. However, use of animal models to identify these repair and regeneration signaling pathways is critical to the development of new therapies aimed at improving pulmonary function following lung injury. The mouse pneumonectomy model utilizes compensatory lung growth to isolate those repair and regeneration signals in order to more clearly define mechanisms of alveolar re-septation. Here, we describe our technique for performing mouse pneumonectomy and sham pneumonectomy. This technique may be utilized in conjunction with lineage tracing or other transgenic mouse models to define molecular and cellular mechanism of lung repair and regeneration.

Mouse pneumonectomy is a commonly employed model of compensatory lung growth. This procedure can be used in conjunction with lineage tracing or transgenic mouse models to elucidate underlying mechanisms.

Telafi Akciğer Büyüme Fare Pnömonektomi Modeli

In humans, disrupted repair and remodeling of injured lung contributes to a host of acute and chronic lung disorders which may ultimately lead to ...

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Primer Tümör ve Akciğer Metastazı Eğitim için MEF Hücre İzolasyonu

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

Establishment of a Human Multiple Myeloma Xenograft Model in the Chicken to Study Tumor Growth, Invasion and Angiogenesis

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the lack of the bone microenvironment and auto/paracrine growth factors human MM cells are difficult to cultivate. Therefore, there is an urgent need to establish proper in vitro and in vivo culture systems to study the action of novel therapeutics on human MM cells. Here we present a model to grow human multiple myeloma cells in a complex 3D environment in vitro and in vivo. MM cell lines OPM-2 and RPMI-8226 were transfected to express the transgene GFP and were cultivated in the presence of human mesenchymal cells and collagen type-I matrix as three-dimensional spheroids. In addition, spheroids were grafted on the chorioallantoic membrane (CAM) of chicken embryos and tumor growth was monitored by stereo fluorescence microscopy. Both models allow the study of novel therapeutic drugs in a complex 3D environment and the quantification of the tumor cell mass after homogenization of grafts in a transgene-specific GFP-ELISA. Moreover, angiogenic responses of the host and invasion of tumor cells into the subjacent host tissue can be monitored daily by a stereo microscope and analyzed by immunohistochemical staining against human tumor cells (Ki-67, CD138, Vimentin) or host mural cells covering blood vessels (desmin/ASMA).
In conclusion, the onplant system allows studying MM cell growth and angiogenesis in a complex 3D environment and enables screening for novel therapeutic compounds targeting survival and proliferation of MM cells.

Human multiple myeloma (MM) cells require the supportive microenvironment of mesenchymal cells and extracellular matrix components for survival and proliferation. We established an in vivo chicken embryo model with engrafted human myeloma and mesenchymal cells to study effects of cancer drugs on tumor growth, invasion and angiogenesis.

Chicken İnsan Multipl Miyelom Xenograftlarında Modeli Kurulması Tümör Büyüme, Invasion ve Anjiogenez Eğitim için

Multiple myeloma (MM), a malignant plasma cell disease, remains incurable and novel drugs are required to improve the prognosis of patients. Due to the ...