Bu araştırma, Zhejiang Eyaleti Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (Z23H290001, LY19H280001) tarafından desteklenmiştir; Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibeleri (82274364, 81673607 ve 81774011); Huzhou Bilim ve Teknoloji Hibesi'nin Kamu Refahı Araştırma Projesi'nin yanı sıra (2021GY49, 2018GZ24). Zhejiang Çin Tıp Üniversitesi, Çin Tıp Bilimleri Akademisi, Tıbbi Araştırma Merkezi Kamu Platformu'ndan gelen büyük yardım, teknik destek ve deneysel destek için teşekkür ederiz.

1. Malzeme hazırlığı
<ol><li>12 mL DMEM ortamında (%10 fetal sığır serumu ve 100 U/mL penisilin-streptomisin) 2 x 106 Panc02 hücresini kültürleyin ve 48 saat boyunca %5 karbondioksit ve %95 hava atmosferinde 37 °C ve %95 nemde muhafaza edin.</li>
	<li>Panc02 hücrelerini toplayın, 28 x g'de 2 dakika santrifüjleyin ve ardından süpernatanı atın. Numunenin uygun boyutta (1 x 107 hücre) olduğundan emin olun, aksi takdirde aşağıdaki fiksasyon ve dehidrasyon adımları iyi çalışmayacaktır.</li>
	<li>Taze Panc02 hücrelerini 1.5 mL mikro santrifüj tüplerine gece boyunca 4 °C'de sabitlemek için fiksatif olarak 1 mL %2.5 glutaraldehit ekleyin. NOT: Numunelerin, aşağıdaki adımların her birinde (adım 1.3-1.11) 5 dakika boyunca 1.006 x g'da santrifüjlenmesi gerekir.</li>
	<li>Fiksatifi aspire edin ve numuneleri 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez durulayın ve ardından her biri 10 dakika oda sıcaklığında çift damıtılmış su (ddH2O) ile iki kez durulayın.</li>
	<li>1 saat boyunca 4 ° C'de 1:1 oranında% 1 osmiyum tetroksit (OsO4) ve% 1.5 potasyum ferrosiyanür içeren 50 μL çözelti ekleyin. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca 0.1 M PBS ile iki kez durulayın ve 10 dakika daha ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>1 mL% 1 tiyokarbohidrazid (TCH) ekleyin, oda sıcaklığında 30 dakika ila 1 saat inkübe edin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>50 μL% 1 OsO4 ekleyin, oda sıcaklığında 1 saat sabitleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>Gece boyunca 4 °C'de 1 mL %2 uranil asetat ekleyin ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca dört kez ddH2O ile durulayın.</li>
	<li>İlave 1 saatlik inkübasyon için 60 ° C'de 1 mL Walton çözeltisi (10 mL 0.03 mol / L aspartik asit stok çözeltisi içinde çözülmüş 0.066 g kurşun nitrat) ekleyin.</li>
	<li>ddH2O ile her seferinde 10 dakika boyunca dört kez durulayın ve ardından her seferinde 10 dakika boyunca kademeli bir alkol serisinde kurutun:% 50 alkol,% 70 alkol,% 80 alkol ve% 90 alkol 1x ve% 100 alkol 2x. Ardından, her seferinde 10 dakika boyunca iki kez %100 asetonda kurutun. Dehidrasyon için her çözeltiden 1 mL kullanın.</li>
	<li>200 μL asetonu Pon 812 epoksi reçine ile 3:1, 1:1 ve 1:3 oranında karıştırın. Numuneyi sırasıyla 2 saat, 4 saat ve 4 saat oda sıcaklığında reçineye batırın ve ardından gece boyunca emprenye etmek için %100 Pon 812 epoksi reçineyi alın. NOT: Boyama ve reçine gömme adımlarını gerçekleştirirken, bunlar toksik maddeler olduğundan çeker ocakta çalıştırılması önemlidir. Ek olarak, deney sırasında laboratuvar önlükleri ve solvente dayanıklı eldivenler giyilmelidir.</li>
	<li>Numuneleri bir gömme kalıba koyun ve ardından polimerize olması için 48 saat boyunca 60 °C'de bir fırına koyun. Numunenin etrafındaki reçine görünümünü azaltmak için düz gömme29 kullanın. Bu, numune kurulumunu basitleştirir ve şarj artefaktlarının sonraki görüntü segmentasyonu üzerindeki etkisini azaltır. NOT: Daha sonra yatay bir kesme yüzeyi oluşturmak için, aşırı doldurmamaya dikkat ederek kalıp deliğine az miktarda reçine eklenebilir.</li>
	<li>Silikon gofretleri önce yıkayarak ve ardından konsantreH2S04/H2O2solüsyonu ile 30 dakika hidrofilize ederek hazırlayın. Hidrofilize silikon gofretler üzerinde 70 nm kalınlığında seri dilim şeritleri ultramikrotom kullanarak toplayın ve 60 °C fırında 10 dakika kurutun. NOT: Dilim kaybını veya deformasyonunu önlemek için dilim gofretlerin yüzeyine doğru yüzerken dilimi yavaşça yakalayın.</li>
</ol>2. Görüntü elde etme ve üç boyutlu rekonstrüksiyon
<ol><li>Sahneye bir silikon gofret monte etmeden önce, bölümleri üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve havayla kurutun. 1 cm x 0,5 cm boyutunda iletken bir karbon bant kesin ve numune kurulumunu tamamlamak için bunu silikon gofret ile SEM numune aşaması arasına yapıştırın (Şekil 2E).</li>
	<li>FE-SEM hızlandırma voltajı parametresini 2 mm çalışma mesafesi ile 4 kV'a ayarlayın (Şekil 3B ve Tablo 1). NOT: Sinyal-gürültü oranını iyileştirmek ve görüntüdeki paraziti azaltmak için, mümkün olduğunca düşük büyütme oranlarında gözlemleyin. Çoklu arttıkça, SEM'in tarama aralığı azalır ve bu da görüntülerde yük birikiminde bir artışa yol açar.</li>
	<li>Üst menü çubuğundaki H/L simgesine tıklayın. İlk olarak, düşük büyütmede, hedef dilim şeritlerinin ilk bölümünü yönlendirin ve ardından yüksek büyütme moduna geçmek için Y /Y seçeneğine (Şekil 3A) tekrar tıklayın; Görüntü parlaklığını, kontrastını ve büyütmesini ayarlayarak ilgilenilen yapıya uygun bir görüntü toplayın.</li>
	<li>Proje Görünümü > Açık Veri'yi seçin ve analiz edilecek görüntü dosyalarını yazılıma aktarın.</li>
	<li>Dilimleri Hizala > Düzenle'ye tıklayarak resimleri hizalayın (Şekil 4B) ve görüntü saydamlığını değiştirerek sol alt menü çubuğundaki Yoğunluk Aralığı değerini ayarlayın. Burada yarı otomatik bir hizalama stratejisi kullanın; Özellikle, otomatik hizalama yoluyla, resimlerin önceki bir resimle çakışmasını sağlayın ve ardından manuel ince ayar yapın. NOT: Bu çalışmada, hizalama işlemi sırasında, bir önceki görüntü referans olarak kullanılmış ve iki görüntünün hedef yapısını maksimum düzeyde örtüştürmek için taşıma ve döndürme işlemlerinden yararlanılmıştır. Geçerli Dilim Çiftini Hizala'ya tıklamak, görüntülerin otomatik olarak hizalanmasına yardımcı olabilir, ancak yanlış yerleştirme meydana gelebilir.</li>
	<li>Alt Birimi Ayıkla modülünü seçin ve hizalanmış veri kümelerini tüm yığının çakışan kısmının boyutuna sığacak şekilde kırpın.</li>
	<li>Segmentasyon alt bölümünün altında (Şekil 4C), Segmentasyon > Kaydet> Yeniden Örnekle'yi seçin. Sihirli Değnek eşiğini ve boyutunu seçin Fırça doğru aralığı seçmek için araç. Burada yine, uygun bir geniş alanı otomatik olarak seçmek için önce Sihirli Değnek'i kullanarak yarı otomatik bir segmentasyon yöntemini benimseyin ve ardından ayrıntıları doğru bir şekilde tanımlamak için Fırçayı kullanın. NOT: Sihirli Değnek , Maskeleme değerini değiştirerek ve Çizim Sınırı Çizgisi kullanılarak, ilgilenilen yapı ile çevresindeki yapılar arasında var olan piksel yoğunluğundaki bariz farklılıklara dayalı olarak görüntüleri bölümlere ayırmak için uygulanabilir. Görüntü alımı sırasında oluşan şarj artefaktlarını ayırt edemez. Bu nedenle, hedef bölgeler için yanlış segmentasyona neden olabilir. Fırça aracı, biyolojik yapıları doğru bir şekilde yeniden yapılandırmak için manuel olarak bölümlere ayırmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Segmentasyon > Seçimi altında, seçilen alanı eklemek için + simgesine tıklayın (Şekil 4C).</li>
	<li>İlgilenilen mikro yapıları yeniden oluşturmak için seçim tamamlanana kadar farklı görüntülerde aynı hedef yapıyı seçmek için yukarıdaki adımı (2.8) tekrarlayın. NOT: Mitokondriyal yeniden modelleme işlemleri sırasında, hedef nesnenin seçimi, bir grup ardışık görüntünün ortasındaki resimden yapılmalıdır. Gerekli alan ilk veya son resimden seçilirse, rekonstrüksiyon sonucu tam bir 3D görselleştirme sunamayacaktır.</li>
	<li>Bölgesel segmentasyonu tamamladıktan sonra, nesnenin boyutu ve resim çözünürlüğü için en iyi sonuçlara göre görüntü dosyasını oluşturun. Kırpma Düzenleyicisi'ne tıklayın ve ardından Sanal Kaydırıcı kutusuna 6 sayısını girin (Şekil 4C).</li>
	<li>Soldaki açılır menüde, Proje alt bölümünün altındaki gri alana sağ tıklayın ve Yüzey Oluştur > Oluştur > Uygula'yı seçin. Oluşturulan dosyada, yüzey yapısını ve 3B gösterimi oluşturmak için Yüzey Görünümü modülünü kullanın.</li>
</ol>3. Niceleme
<ol><li>Küçük Noktaları Kaldır'a tıklayın > uygulayın (Şekil 4D). Proje alt bölümünün altında, gri alana sağ tıklayın ve Etiket Analizi > Uygula'yı seçin (Şekil 4D).</li>
	<li>Sütunun adını özelleştirin ve bir ölçü grubu seçin. Yerel Ölçümler kutusundan Volume3d ve Length3d'yi seçin. </li>
	<li>Ekranın sol alt köşesindeki Uygula düğmesine tıklayın. Verileri kopyalayın ve GraphPad gibi istatistiksel yazılımlarda grafik çizin.</li>
</ol>

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Cristae'yi Görselleştirmek için 3D Teknik

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Burada sunulan yöntem, seri ultra ince kesitlerden oluşturulan 2D tomografik görüntülerin istiflenmesine ve segmentasyonuna elektron mikroskobu ve görüntü işleme teknolojisinin uygulanmasını içeren 3D rekonstrüksiyon tekniğini uygulamak için adım adım yararlı bir kılavuzdur. Bu protokol, yapıların yüksek çözünürlük düzeyinde güçlü tekrarlanabilirliği ve daha yüksek doğrulukta avantajlarına sahip olan organel üst yapısının 3D görselleştirilmesi ile ele alınabilecek 2D görüntüle...

Mitokondri, hücredeki en önemli organellerden biridir. Hücresel biyoenerjetik ve metabolizmanın merkezi olarak hizmet ederler 1,2 ve kanserde kritik bir rol oynarlar3. Pankreas kanseri (PK), hızlı yayılımı ve yüksek ölüm oranı nedeniyle tedavisi en zor kanserlerdenbiridir. Esas olarak mitokondriyal morfolojideki 3,5,6,7 değişikliklerin neden olduğu mitokondriyal disfonksiyon, PC8'in altında yatan hastalık mekanizmalarıyla ilişkilendirilmiştir. Mitokondriler de oldukça dinamiktir, bu da ağ bağlantılarındaki ve cristae yapılarındaki sık ve dinamik değişikliklerle yansıtılır9. Cristae yapısının yeniden şekillendirilmesi, tümör hücresi büyümesi, metastaz ve tümör mikroçevre değişiklikleri sırasında önemli ölçüde değişen mitokondriyal fonksiyonu vehücresel durumu 10,11 doğrudan etkileyebilir12,13.
Son yıllarda, bilim adamları bu organeli EM gözlemi14,15,16,17; örneğin, araştırmacılar 3D rekonstrüksiyon tekniklerini kullanarak mitokondriyal dinamiklerianaliz ettiler 6,7,18,19. Elektron mikroskobu görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için genel konsept ve yöntem resmi olarak 196820 gibi erken bir tarihte oluşturuldu ve T4 faj kuyruğunu yeniden yapılandırmak için elektron mikroskobu, elektron kırınımı ve bilgisayar görüntü işlemenin birleştirilmesini içeriyordu. Şimdiye kadar, elektron mikroskobu 3D görüntüleme teknolojisi, görüntü çözünürlüğü 21, otomasyon derecesi22 ve işlem hacmi 23 açısından önemli ilerlemeler kaydetmiş ve biyolojik araştırmalarda doku seviyesinden nanometre ölçeğindeorganel ultrayapı seviyesine kadar giderek daha geniş bir ölçekte kullanılmaktadır24. Son yıllarda, elektron mikroskobu 3D görüntüleme de çok çeşitli uygulamalar için umut verici bir teknoloji haline gelmiştir25,26,27.
Mitokondriyal kristalara artan ilgi, özellikle ultrastrüktürel hacim görüntüleme için temel gereksinimleri göstermektedir. Transmisyon elektron mikroskobu (TEM), bir bakır ızgara (400 mesh)28 üzerinde toplanan numuneleri, kesitten geçen elektron ışını ile görselleştirmek için kullanılmıştır. Bununla birlikte, bakır ızgaranın sınırlı aralığı nedeniyle, aynı numunenin sürekli dilimlerini tam olarak görüntülemekimkansızdır 29. Bu, TEM görüntüleme sırasında hedef yapıların incelenmesini zorlaştırır. Ek olarak, TEM, birden fazla dilimin kesilmesi ve toplanması ve bunların sırayla görüntülenmesi21 dahil olmak üzere zaman alıcı ve hataya açık manuel görevlere dayanır, bu nedenle büyük hacimli numunelerin ultrastrüktürel rekonstrüksiyonları için uyarlanmamıştır23. Şu anda, büyük hacimli numune görüntülemenin yüksek çözünürlüklü rekonstrüksiyonu, TEM kamera dizisi (TEMCA)30 veya iki ikinci nesil TEMCA sistemi (TEMCA2)31 gibi kısa sürede otomatik yüksek verimli görüntülemeye olanak tanıyan özel ekipmanların kullanılmasıyla gerçekleştirilmektedir. Bununla birlikte, bu tür görüntüleme, özelleştirilmiş ekipman gereksinimi nedeniyle elde edilmesi kolay ve evrensel olma avantajına sahip değildir.
TEM ile karşılaştırıldığında, SEM32,33'e dayalı geniş alanlar için otomatik olarak binlerce seri hacimsel görüntü oluşturma yöntemi, seri görüntülemenin verimliliğini ve güvenilirliğini artırır ve daha yüksek z-çözünürlükleri sunar 34. Örneğin, seri blok yüz taramalı elektron mikroskobu (SBF-SEM) ve odaklanmış iyon ışını taramalı elektron mikroskobu (FIB-SEM), yüksek hız, verimlilik veçözünürlük 35,36 ile ultrayapının 3D rekonstrüksiyonunu gerçekleştirmeyi mümkün kılmıştır. Bununla birlikte, blok yüzeyinin SBF-SEM'in elmas bıçağı ile veya FIB-SEM33,37'nin odaklanmış iyon ışını ile frezelenerek mekanik olarak traşlanması kaçınılmazdır. İki yöntemin numunelere zarar vermesi nedeniyle, daha fazla analiz için aynı hedef yapıyı tekrar oluşturmak mümkün değildir38,39,40. Ek olarak, az sayıda çalışma, patolojik değişiklikleri gözlemlemek için EM kullanarak kanser hücrelerinin 3D organel ultrayapısını yeniden yapılandırmaya çalışmıştır12. Bu nedenlerden dolayı, pankreas kanseri hücreleri gibi kanser hücrelerinin patolojik mekanizmalarını daha fazla aydınlatmak için, mitokondriyal üst yapıyı kristae seviyesinde analiz etmek için bir ultramikrotom ve bir alan emisyon taramalı elektron mikroskobu (FE-SEM) kullanarak seri kesit görüntülerinin 3D rekonstrüksiyonu için yeni bir teknoloji öneriyoruz; Bu teknoloji ile verimli ve erişilebilir bir yöntem kullanılarak yüksek çözünürlüklü veriler elde edilebilir. Bir ultramikrotom kullanılarak yapılan seri ultra ince kesitler, bir ızgara kutusunda yarı kalıcı olarak saklanabilir ve birkaç yıl sonra bile birden çok kez yeniden görüntülenebilir41. FE-SEM, yüksek çözünürlüklü görüntüleme, yüksek büyütme ve çok yönlülük sağlama yeteneği nedeniyle çeşitli araştırma alanlarında bir araç olarak oldukça değerlidir42. Organellerin ince yapısını 3D olarak sergilemek amacıyla, FE-SEM43,44 tarafından üretilen geri saçılan elektronları kullanarak faydalı çözünürlüğe sahip seri 2D görüntü yığınları üretme tekniği, özel ekipman olmadan hedef bölgelerin veya bunlarla ilişkili yapıların yüksek verimli ve çok ölçekli görüntülemesini elde etmek için de kullanılabilir 45. Yük artefaktlarının oluşturulması, elde edilen görüntülerin kalitesini doğrudan etkiler, bu nedenle bekleme süresini kısa tutmak özellikle önemlidir.
Bu nedenle, bu çalışma, mitokondriyal cristae46'nın 3 boyutlu yapısını yeniden yapılandırmak için bu SEM tekniğinde kullanılan deneysel prosedürleri detaylandırmaktadır. Spesifik olarak, mitokondriyal bölgelerin yarı otomatik segmentasyonunu elde etmek ve geleneksel OTO numune hazırlama yöntemi44,47 kullanılarak dilim numuneleri yapmayı da içeren Amira yazılımını kullanarak 3D rekonstrüksiyonu dijitalleştirmek için geliştirilen süreci gösteriyoruz, ultramikrotom dilimleme kullanarak kesit koleksiyonunu tamamlama ve FE-SEM ile sıralı 2D veriler elde etme.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

Sadece bilinmeyen bilgiler açısından zengin değil, aynı zamanda üç boyutlu (3D) bir bakış açısıyla da sofistike olan hücre organeli üst yapısının dinamik özelliklerinin anlaşılması, mekanik çalışmalar için kritik öneme sahiptir. Elektron mikroskobu (EM) iyi bir görüntüleme derinliği sunar ve nanometre ölçeğinde bile hücresel organellerin ultrastrüktürel morfolojisini araştırmak için yüksek çözünürlüklü görüntü yığınlarının yeniden yapılandırılmasına izin verir; bu nedenle, 3D rekonstrüksiyon, eşsiz avantajları nedeniyle önem kazanmaktadır. Taramalı elektron mikroskobu (SEM), aynı ilgi bölgesinden büyük yapıların ardışık dilimler halinde 3D olarak yeniden yapılandırılmasına olanak tanıyan yüksek verimli bir görüntü elde etme teknolojisi sağlar. Bu nedenle, organellerin gerçek 3D ultrayapısını eski haline getirmek için büyük ölçekli 3D rekonstrüksiyonda SEM uygulaması giderek daha yaygın hale geliyor. Bu protokolde, pankreas kanseri hücrelerinde mitokondriyal kristaları incelemek için seri ultra ince kesit ve 3D rekonstrüksiyon tekniklerinin bir kombinasyonunu öneriyoruz. Bu tekniklerin nasıl uygulandığının ayrıntıları, osmiyum-tiyokarbohidrazid-osmiyum (OTO) yöntemi, seri ultra ince kesit görüntüleme ve görselleştirme ekranı dahil olmak üzere bu protokolde adım adım açıklanmaktadır.

Mitochondria are one of the most important organelles in the cell. They serve as the central hub of cellular bioenergetics and metabolism1,2 and play a critical role in cancer3. Pancreatic cancer (PC) is one of the most difficult cancers4 to treat due to its rapid spread and high mortality rate. Mitochondrial dysfunction, which is mainly caused by changes in the mitochondrial morphology3,5,6,7, has been linked to the disease mechanisms underlying PC8. Mitochondria are also highly dynamic, which is reflected by the frequent and dynamic changes in their network connectivity and cristae structure9. The reshaping of the cristae structure can directly impact the mitochondrial function and cellular state10,11, which are significantly altered during tumor cell growth, metastasis, and tumor microenvironment changes12,13.
In recent years, scientists have studied this organelle using EM observation14,15,16,17; for example, researchers have analyzed the mitochondrial dynamics using 3D reconstruction techniques6,7,18,19. The general concept and method for the 3D reconstruction of electron microscopy images were formally established as early as 196820 and involved combining electron microscopy, electron diffraction, and computer image processing to reconstruct the T4 phage tail. Up until now, electron microscopy 3D imaging technology has made significant advancements in terms of the image resolution21, degree of automation22, and processing volume23 and has been used on an increasingly broad scale in biological research, from the tissue level to the organelle ultrastructure level at the nanometer scale24. In recent years, electron microscopy 3D imaging has also become a promising technology for a wide range of applications25,26,27.
The growing attention on mitochondrial cristae particularly illustrates the essential requirements for ultrastructural volume imaging. Transmission electron microscopy (TEM) has been used to visualize samples collected on a copper grid (400 mesh)28, with the electron beam passing through the section. However, due to the limited range of the copper grid, it is impossible to fully image continuous slices of the same sample29. This complicates the study of target structures during TEM imaging. Additionally, TEM relies on time-consuming and error-prone manual tasks, including cutting and collecting multiple slices and imaging them sequentially21, so it is not adapted for ultrastructural reconstructions of large-volume samples23. At present, the high-resolution reconstruction of large-volume sample imaging is achieved through the use of specialized equipment, such as the TEM camera array (TEMCA)30 or two second-generation TEMCA systems (TEMCA2)31, which enable automated high-throughput imaging in a short time. However, this type of imaging does not have the advantage of being easy to obtain and universal due to the requirement for customized equipment.
Compared with TEM, the method for automatically generating thousands of serial volumetric images for large areas based on SEM32,33 enhances the efficiency and reliability of serial imaging and delivers higher z-resolutions34. For example, serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) and focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) have both made it possible to achieve the 3D reconstruction of ultrastructure with high speed, efficiency, and resolution35,36. However, it is inevitable that the block surface is mechanically shaved off by the diamond knife of the SBF-SEM or by milling with the focused ion beam of FIB-SEM33,37. Due to the destructiveness of the two methods to the samples, it is not possible to reconstruct the same target structure again for further analysis38,39,40. In addition, few studies have attempted to reconstruct the 3D organelle ultrastructure of cancer cells using EM to observe pathological changes12. For these reasons, in order to further elucidate the pathological mechanisms of cancer cells, such as pancreatic cancer cells, we propose a novel technology for the 3D reconstruction of serial section images using an ultramicrotome and a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) to analyze the mitochondrial ultrastructure at the cristae level; with this technology, high-resolution data can be acquired using an efficient and accessible method. The serial ultrathin sections made using an ultramicrotome can be semi-permanently stored in a grid case and reimaged multiple times, even after several years41. FE-SEM is highly valued as a tool in various research fields due to its ability to provide high-resolution imaging, high magnification, and versatility42. In an attempt to display the fine structure of organelles in 3D, the technique for producing serial 2D image stacks with useful resolution using back-scattered electrons produced by FE-SEM43,44 can also be used to achieve high-throughput and multi-scale imaging of target regions or their associated structures without special equipment45. The generation of charge artifacts directly affects the quality of the acquired images, so it is particularly important to keep the dwell time short.
Thus, the present study elaborates on the experimental procedures employed in this SEM technique to reconstruct the 3D structure of mitochondrial cristae46. Specifically, we show the process developed to achieve the semi-automatic segmentation of mitochondrial regions and digitize the 3D reconstruction using Amira software, which also involves making slice samples using the conventional OTO specimen preparation method44,47, completing the section collection using ultramicrotome slicing, and acquiring sequential 2D data by FE-SEM.

Yazar Spotlight: Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik  

Pankreas Kanseri Hücrelerinde Mitokondriyal Ultrastrüktürel Değişikliklerin Görselleştirilmesi için Üç Boyutlu Bir Teknik

This project aims to review the anti-cancer effect of drugs by changing the structure at the subcellular nano-scale level, and establishing the link between organelle morphology and the cancer pathological mechanism. This technology combines traditional electron microscopy technology with three dimensional reconstruction technology without special equipment. Compared to other techniques, it can improve imaging efficiency and the reconstruction flexibility, and the real life reconstruction of target structures at any time.So it's highly easy and universal. This technology of three dimensional reconstruction of the continuous ultra-thin slides can repeatedly restore the real stereochemical without specific expensive equipment. It can be used for qualitative and quantitative analysis of all organelles at any time.It realizes the easy operation of observation.

Hücre kültürü sırasında (Şekil 1A), önce pankreas kanseri hücrelerini tam kültür ortamı ile kültürlenmiş bir kontrol grubuna, bir (1S, 3R)-RSL348 (RSL3, bir ferroptoz aktivatörü, 100 nM) grubuna ve bir RSL3 (100 nM) artı ferrostatin-149 (Fer-1, bir ferroptoz inhibitörü, 100 nM) grubuna ayırdık. Yukarıdaki deneysel adımlar sayesinde, taramalı elektron mikroskobu kontrol grubu, RSL3 grubu ve inhibitör grubu (RSL3 + Fer-1...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

Bu protokol, yüksek doğruluk, yüksek çözünürlük ve yüksek verim ile 3D görüntüleme elde etmek için mitokondriyal cristae'nin nasıl yeniden yapılandırılacağını açıklar.

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Bu proje, ilaçların anti-kanser etkisini, hücre altı nano ölçekte yapıyı değiştirerek ve organel morfolojisi ile kanser patolojik mekanizması arasındaki bağlantıyı kurarak gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu teknoloji, geleneksel elektron mikroskobu teknolojisini özel ekipman olmadan üç boyutlu rekonstrüksiyon teknolojisi ile birleştirir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, görüntüleme verimliliğini ve rekonstrüksiyon esnekliğini ve hedef yapıların gerçek hayattaki rekonstrüksiyonunu herhangi bir zamanda artırabilir.Bu yüzden son derece kolay ve evrenseldir. Sürekli ultra ince slaytların üç boyutlu rekonstrüksiyonu teknolojisi, belirli pahalı ekipman olmadan gerçek stereokimyasalı tekrar tekrar geri yükleyebilir. Herhangi bir zamanda tüm organellerin kalitatif ve kantitatif analizi için kullanılabilir.Gözlemin kolay çalışmasını gerçekleştirir.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

1.1K Görüntüleme.  School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University. Bu proje, ilaçların anti-kanser etkisini, hücre altı nano ölçekte yapıyı değiştirerek ve organel morfolojisi ile kanser patolojik mekanizması arasındaki bağlantıyı kurarak gözden geçirmeyi amaçlamaktadır. Bu teknoloji, geleneksel elektron mikroskobu teknolojisini özel ekipman olmadan üç boyutlu rekonstrüksiyon teknolojisi ile birleştirir. Diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, görüntüleme verimliliğini ve rekonstrüksiyon esnekliğini ve hedef yapıların...