מחקר זה נתמך על ידי מענקים של הקרן למדעי הטבע של מחוז ג'ג'יאנג (Z23H290001, LY19H280001); מענקי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82274364, 81673607 ו-81774011); וכן פרויקט מחקר רווחת הציבור של מענק המדע והטכנולוגיה של הוז'ו (2021GY49, 2018GZ24). אנו מעריכים את העזרה הרבה, התמיכה הטכנית והתמיכה הניסיונית מהפלטפורמה הציבורית של מרכז המחקר הרפואי, האקדמיה למדעי הרפואה הסינית, האוניברסיטה לרפואה סינית ג'ג'יאנג.

1. הכנת החומר
<ol><li>תרבית 2 x 106 תאי Panc02 ב 12 מ"ל של DMEM בינוני (10% סרום בקר עוברי ו 100 U / מ"ל של פניצילין-סטרפטומיצין), ולשמור על 37 ° C ו 95% לחות באטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני ו 95% אוויר במשך 48 שעות.</li>
	<li>לאסוף תאי Panc02, צנטריפוגה ב 28 x גרם במשך 2 דקות, ולאחר מכן להשליך את supernatant. ודא כי הדגימה היא בגודל מתאים (1 x 107 תאים), אחרת, שלבי הקיבוע וההתייבשות הבאים לא יפעלו היטב.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 2.5% גלוטראלדהיד כחומר קיבוע כדי לתקן את תאי Panc02 הטריים בצינורות מיקרו-צנטריפוגות 1.5 מ"ל למשך הלילה ב -4 ° C. הערה: הדגימות צריכות להיות צנטריפוגות במהירות של 1,006 x גרם למשך 5 דקות בכל אחד מהשלבים הבאים (שלבים 1.3-1.11).</li>
	<li>יש לשאוף את חומר הקיבוע, ולשטוף את הדגימות פעמיים במי מלח חוצצים בפוספט 0.1M (PBS), ולאחר מכן לשטוף פעמיים במים מזוקקים פעמיים (ddH2O) בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות כל אחת.</li>
	<li>הוסף 50 μL של תמיסה המכילה 1% osmium tetroxide (OsO4) ו 1.5% אשלגן ferrocyanide ביחס של 1: 1 ב 4 ° C במשך 1 שעות. לאחר מכן, שטפו פעמיים עם PBS של 0.1 M במשך 10 דקות בכל פעם, ושטפו עם ddH2O במשך 10 דקות נוספות.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של 1% thiocarbohydrazide (TCH), לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות עד 1 שעה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>יש להוסיף 50 μL של 1% OsO4, לתקן בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>יש להוסיף 1 מ"ל של 2% אורניל אצטט ב-4°C למשך הלילה, ולאחר מכן לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של תמיסת וולטון (0.066 גרם של חנקת עופרת מומסת ב 10 מ"ל של 0.03 mol/L תמיסת מלאי חומצה אספרטית) ב 60 ° C עבור 1 שעה נוספת של דגירה.</li>
	<li>יש לשטוף עם ddH2O ארבע פעמים במשך 10 דקות בכל פעם, ולאחר מכן לייבש בסדרת אלכוהול מדורגת למשך 10 דקות בכל פעם: 50% אלכוהול, 70% אלכוהול, 80% אלכוהול, 90% אלכוהול 1x ו-100% אלכוהול 2x. לאחר מכן, יש לייבש ב-100% אצטון פעמיים למשך 10 דקות בכל פעם. השתמש 1 מ"ל של כל פתרון עבור התייבשות.</li>
	<li>ערבבו 200 מיקרוליטר אצטון עם שרף אפוקסי Pon 812 ביחס של 3:1, 1:1 ו-1:3. השרו את הדגימה בשרף בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, 4 שעות ו-4 שעות, בהתאמה, ולאחר מכן קחו את שרף האפוקסי 100% Pon 812 כדי לספוג למשך הלילה. הערה: בעת ביצוע שלבי הצביעה והשמעת השרף, חשוב לפעול במכסה אדים מכיוון שמדובר בחומרים רעילים. בנוסף, יש ללבוש מעילי מעבדה וכפפות עמידות בפני ממסים במהלך הניסוי.</li>
	<li>הכניסו את הדגימות לתבנית הטבעה, ולאחר מכן הכניסו לתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפילמור. השתמשו בהטבעה שטוחה29 כדי להפחית את מראה השרף סביב הדגימה. פעולה זו מפשטת את התקנת הדגימה ומפחיתה את ההשפעה של טעינת תוצרים על פילוח התמונה הבא. הערה: כדי ליצור לאחר מכן משטח חיתוך אופקי, ניתן להוסיף כמות קטנה של שרף לחור התבנית, תוך הקפדה לא למלא אותו יתר על המידה.</li>
	<li>הכינו פרוסות סיליקון על ידי שטיפתם תחילה ולאחר מכן הידרופיליזציה עם תמיסת H 2 SO4/H 2 O2מרוכזת למשך 30 דקות. אספו רצועות פרוסות סדרתיות בעובי של 70 ננומטר על פרוסות הסיליקון שעברו הידרופיליזציה באמצעות אולטרה-מיקרוטום, וייבשו אותן בתנור של 60°C למשך 10 דקות. הערה: לכוד באיטיות את הפרוסה כשהפרוסה צפה על פני השטח של פרוסות הפרוסות כדי למנוע אובדן או עיוות של הפרוסה.</li>
</ol>2. רכישת תמונה ושחזור תלת מימדי
<ol><li>לפני הרכבת רקיק סיליקון על הבמה, לשטוף את החלקים עם מים מזוקקים שלוש פעמים, ולייבש אותם באוויר. חתכו סרט פחמן מוליך בגודל של 1 ס"מ x 0.5 ס"מ, והדביקו אותו בין פרוסת הסיליקון לשלב הדגימה של SEM כדי להשלים את הגדרת הדגימה (איור 2E).</li>
	<li>הגדר את פרמטר המתח המאיץ FE-SEM ל- 2 kV עם מרחק עבודה של 4 מ"מ (איור 3B וטבלה 1). הערה: כדי לשפר את יחס האות לרעש ולהפחית את הרעש בתמונה, צפה בהגדלות נמוכות במידת האפשר. ככל שהריבוי גדל, טווח הסריקה של ה-SEM מצטמצם, מה שמוביל לעלייה בצבירת המטען על התמונות.</li>
	<li>לחץ על סמל H/L בשורת התפריטים העליונה. תחילה, בהגדלה נמוכה, כוונו את החלק הראשון של רצועות פרוסת היעד, ולאחר מכן לחצו שוב על האפשרות H/L (איור 3A) כדי לעבור למצב הגדלה גבוהה; אסוף תמונה מתאימה למבנה העניין על-ידי התאמת הבהירות, הניגודיות וההגדלה של התמונה.</li>
	<li>בחר Project View > Open Data וייבא את קבצי התמונה לניתוח לתוך התוכנה.</li>
	<li>יישרו את התמונות בלחיצה על ' יישור פרוסות' >'עריכה ' (איור 4B), והתאימו את הערך 'טווח עוצמה ' בשורת התפריטים השמאלית התחתונה באמצעות שינוי שקיפות התמונה. כאן, השתמש באסטרטגיית יישור חצי אוטומטית; באופן ספציפי, באמצעות יישור אוטומטי, הפוך את התמונות לחפיפה עם תמונה קודמת ולאחר מכן בצע כוונון עדין ידני. הערה: בעבודה זו, במהלך תהליך היישור, התמונה הקודמת שימשה כהפניה, ופעולות ההזזה והסיבוב נוצלו כדי לחפוף באופן מרבי את מבנה היעד של שתי התמונות. לחיצה על Align Current Slice Pair יכולה לעזור ליישר את התמונות באופן אוטומטי, אך עלולה להתרחש טעות במיקום.</li>
	<li>בחרו במודול 'חלץ אמצעי אחסון משנה' וגזור את ערכות הנתונים המיושרות כך שיתאימו לגודל החלק החופף של הערימה כולה.</li>
	<li>תחת תת-המקטע סגמנטציה (איור 4C), בחר דגימה מחדש > סגמנטציה > שמור. בחרו בסף מטה הקסם ובגודל הכלי מברשת לבחירת הטווח הנכון. גם כאן, אמצו שיטת סגמנטציה חצי אוטומטית על ידי שימוש תחילה בשרביט הקסמים כדי לבחור באופן אוטומטי שטח גדול מתאים, ולאחר מכן השתמשו במברשת כדי לתאר במדויק את הפרטים. הערה: ניתן להחיל את מטה הקסם על תמונות מקטעים בהתבסס על ההבדלים הברורים בעוצמת הפיקסלים הקיימת בין מבנה העניין לבין המבנים הסובבים אותו על-ידי שינוי ערך המסיכה ושימוש בקו מגבלת הציור. הוא אינו מסוגל להבחין בין תוצרי הטעינה שנוצרו במהלך רכישת התמונה. לכן, זה עלול לגרום לפילוח שגוי עבור אזורי היעד. ניתן להשתמש בכלי מברשת כדי לפלח ידנית כדי לשחזר במדויק את המבנים הביולוגיים.</li>
	<li>תחת פילוח > בחירה, לחץ על סמל + כדי להוסיף את האזור שנבחר (איור 4C).</li>
	<li>חזור על השלב לעיל (2.8) לבחירת אותו מבנה יעד בתמונות שונות עד להשלמת הבחירה לשחזור המיקרו-מבנים המעניינים. הערה: במהלך תהליכי העיצוב מחדש של המיטוכונדריה, הבחירה של אובייקט היעד חייבת להתבצע מתוך התמונה באמצע קבוצה של תמונות רציפות. אם האזור הדרוש נבחר מהתמונה הראשונה או האחרונה, תוצאת השחזור לא תוכל להציג הדמיה תלת-ממדית מלאה.</li>
	<li>לאחר השלמת הפילוח האזורי, צור את קובץ התמונה בהתאם לתוצאות הטובות ביותר עבור גודל האובייקט ורזולוציית התמונה. לחץ על עורך החיתוך ולאחר מכן הזן את הספרה 6 בתיבה המחוון הווירטואלי (איור 4C).</li>
	<li>בתפריט הנפתח משמאל, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור תחת סעיף המשנה Project ובחר צור משטח > צור > החל. בקובץ שנוצר, השתמש במודול Surface View כדי ליצור את מבנה פני השטח ואת הייצוג התלת-ממדי.</li>
</ol>3. כימות
<ol><li>לחצו על ' הסר כתמים קטנים' > להחיל (איור 4D). תחת תת-המקטע Project , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על האזור האפור ובחר Label Analysis > Apply (איור 4D).</li>
	<li>התאם אישית את שם העמודה ובחר קבוצת מידה. בחר Volume3d ו- Length3d בתיבה מדידות מקוריות. </li>
	<li>לחץ על הלחצן החל בפינה השמאלית התחתונה של המסך. העתק את הנתונים, וגרף בתוכנה הסטטיסטית, כגון GraphPad.</li>
</ol>

טכניקה תלת ממדית לדמיין כריסטאה מיטוכונדריאלית בתאי סרטן הלבלב

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

השיטה המוצגת כאן היא מדריך שימושי שלב אחר שלב ליישום טכניקת השחזור התלת-ממדי, הכוללת יישום מיקרוסקופ אלקטרונים וטכנולוגיית עיבוד תמונה לערימה וסגמנטציה של תמונות טומוגרפיות דו-ממדיות הנוצרות מקטעים אולטרה-דקים סדרתיים. פרוטוקול זה מדגיש מגבלה של תמונות דו-ממדיות שניתן לטפל בהן על ידי הד...

מיטוכונדריה הם אחד האברונים החשובים ביותר בתא. הם משמשים כמרכז המרכזי של ביו-אנרגטיקה תאית ומטבוליזם 1,2 וממלאים תפקיד קריטי בסרטן3. סרטן הלבלב (PC) הוא אחד מסוגי הסרטן הקשיםביותר לטיפול בשל התפשטותו המהירה ושיעור התמותה הגבוה. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה, הנגרם בעיקר על ידי שינויים במורפולוגיה המיטוכונדריאלית 3,5,6,7, נקשר למנגנוני המחלה העומדים בבסיס PC8. מיטוכונדריה הם גם דינמיים מאוד, אשר בא לידי ביטוי על ידי שינויים תכופים ודינמיים בקישוריות הרשת שלהם ואת מבנה cristae9. העיצוב מחדש של מבנה הקריסטה יכול להשפיע ישירות על תפקוד המיטוכונדריה ועל המצב התאי10,11, אשר משתנים באופן משמעותי במהלך צמיחת תאי הגידול, גרורות ושינויים במיקרו-סביבה של הגידול12,13.
בשנים האחרונות, מדענים חקרו אברון זה באמצעות תצפית EM14,15,16,17; לדוגמה, חוקרים ניתחו את הדינמיקה המיטוכונדריאלית באמצעות טכניקות שחזור תלת-ממדיות 6,7,18,19. הרעיון הכללי והשיטה לשחזור תלת-ממדי של תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים נקבעו רשמית כבר בשנת 196820 וכללו שילוב של מיקרוסקופ אלקטרונים, עקיפה אלקטרונית ועיבוד תמונה ממוחשב כדי לשחזר את זנב הפאג T4. עד כה, טכנולוגיית הדמיה תלת-ממדית של מיקרוסקופ אלקטרונים עשתה התקדמות משמעותית במונחים של רזולוציית תמונה 21, דרגת אוטומציה22 ונפח עיבוד 23 ושימשה בקנה מידה רחב יותר ויותר במחקר ביולוגי, מרמת הרקמה ועד לרמת האולטרה-מבנה של אברונים בקנה מידה ננומטרי24. בשנים האחרונות, הדמיית תלת מימד במיקרוסקופ אלקטרונים הפכה גם לטכנולוגיה מבטיחה למגוון רחב של יישומים25,26,27.
תשומת הלב הגוברת על cristae מיטוכונדריאלי ממחיש במיוחד את הדרישות החיוניות עבור הדמיית נפח ultrastructural. מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) שימש להמחשת דגימות שנאספו על רשת נחושת (400 רשת)28, כאשר קרן האלקטרונים עוברת דרך הקטע. עם זאת, בשל הטווח המוגבל של רשת הנחושת, אי אפשר לצלם באופן מלא פרוסות רציפות של אותו מדגם29. זה מסבך את המחקר של מבני המטרה במהלך הדמיה TEM. בנוסף, TEM מסתמך על משימות ידניות גוזלות זמן ומועדות לשגיאות, כולל חיתוך ואיסוף פרוסות מרובות והדמיה שלהן ברצף21, כך שהוא אינו מותאם לשחזורים אולטרה-מבניים של דגימות בנפח גדול23. כיום, שחזור ברזולוציה גבוהה של דימות דגימה בנפח גדול מושג באמצעות שימוש בציוד מיוחד, כגון מערך מצלמות TEM (TEMCA)30 או שתי מערכות TEMCA מהדור השני (TEMCA2)31, המאפשרות הדמיה אוטומטית בתפוקה גבוהה תוך זמן קצר. עם זאת, סוג זה של הדמיה אין את היתרון של להיות קל להשגה אוניברסלי בשל הדרישה ציוד מותאם אישית.
בהשוואה ל-TEM, השיטה ליצירה אוטומטית של אלפי תמונות נפחיות סדרתיות עבור אזורים גדולים בהתבסס על SEM 32,33 משפרת את היעילות והאמינות של הדמיה טורית ומספקת רזולוציות z גבוהות יותר34. לדוגמה, מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוקים סדרתי (SBF-SEM) ומיקרוסקופ אלקטרונים לסריקת קרן יונים ממוקדת (FIB-SEM) אפשרו שניהם להשיג שחזור תלת-ממדי של אולטרה-מבנה במהירות גבוהה, יעילות ורזולוציה35,36. עם זאת, אין מנוס מכך שמשטח הבלוק מגולח מכנית על ידי סכין היהלום של SBF-SEM או על ידי כרסום עם קרן היונים הממוקדת של FIB-SEM33,37. בשל ההרסניות של שתי השיטות לדגימות, לא ניתן לשחזר שוב את אותו מבנה מטרה לניתוח נוסף38,39,40. בנוסף, מחקרים מעטים ניסו לשחזר את מבנה העל של אברונים תלת-ממדיים של תאים סרטניים באמצעות EM כדי לצפות בשינויים פתולוגיים12. מסיבות אלה, על מנת להבהיר עוד יותר את המנגנונים הפתולוגיים של תאים סרטניים, כגון תאי סרטן הלבלב, אנו מציעים טכנולוגיה חדשנית לשחזור תלת-ממדי של תמונות חתך סדרתי באמצעות אולטרה-מיקרוטום ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק פליטת שדה (FE-SEM) לניתוח מבנה העל המיטוכונדריאלי ברמת הקריסטה; באמצעות טכנולוגיה זו ניתן לרכוש נתונים ברזולוציה גבוהה בשיטה יעילה ונגישה. את החלקים האולטרה-דקים הסדרתיים המיוצרים באמצעות אולטרה-מיקרוטום ניתן לאחסן באופן קבוע למחצה במארז רשת ולצלם מחדש מספר פעמים, גם לאחר מספר שנים41. FE-SEM מוערך מאוד ככלי בתחומי מחקר שונים בשל יכולתו לספק הדמיה ברזולוציה גבוהה, הגדלה גבוהה ורבגוניות42. בניסיון להציג את המבנה העדין של אברונים בתלת-ממד, הטכניקה לייצור ערימות תמונה דו-ממדיות סדרתיות ברזולוציה שימושית באמצעות אלקטרונים מפוזרים לאחור המיוצרים על ידי FE-SEM 43,44 יכולה לשמש גם להשגת הדמיה בתפוקה גבוהה ובקנה מידה רב של אזורי מטרה או מבנים הקשורים אליהם ללא ציוד מיוחד 45. יצירת תוצרי המטען משפיעה ישירות על איכות התמונות שנרכשו, ולכן חשוב במיוחד לשמור על זמן השהייה קצר.
לפיכך, המחקר הנוכחי מרחיב את ההליכים הניסיוניים המשמשים בטכניקת SEM זו כדי לשחזר את המבנה התלת-ממדי של cristaeמיטוכונדריאלי 46. באופן ספציפי, אנו מראים את התהליך שפותח להשגת סגמנטציה חצי-אוטומטית של אזורים מיטוכונדריאליים ודיגיטציה של השחזור התלת-ממדי באמצעות תוכנת Amira, הכוללת גם הכנת דגימות פרוסה באמצעות שיטת הכנת דגימות OTO קונבנציונלית44,47, השלמת איסוף החתכים באמצעות חיתוך אולטרה-מיקרוטומי, והשגת נתונים דו-ממדיים רציפים על ידי FE-SEM.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

הבנת התכונות הדינמיות של מבנה העל של אברוני התא, שהוא לא רק עשיר במידע לא ידוע אלא גם מתוחכם מנקודת מבט תלת-ממדית (תלת-ממדית), היא קריטית למחקרים מכניסטיים. מיקרוסקופ אלקטרונים (EM) מציע עומק הדמיה טוב ומאפשר שחזור של ערימות תמונה ברזולוציה גבוהה כדי לחקור את המורפולוגיה האולטרה-סטרוקטורלית של אברוני התא אפילו בקנה מידה ננומטרי; לכן, שחזור תלת מימד צובר חשיבות בשל היתרונות שאין דומה לו. מיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) מספק טכנולוגיית רכישת תמונה בתפוקה גבוהה המאפשרת שחזור מבנים גדולים בתלת-ממד מאותו אזור עניין בפרוסות עוקבות. לכן, היישום של SEM בשחזור תלת ממדי בקנה מידה גדול כדי לשחזר את ultrastructure 3D האמיתי של אברונים הופך נפוץ יותר ויותר. בפרוטוקול זה, אנו מציעים שילוב של חתך אולטרה דק סדרתי וטכניקות שחזור תלת-ממדיות כדי לחקור קריסטות מיטוכונדריאליות בתאי סרטן הלבלב. הפרטים על האופן שבו טכניקות אלה מבוצעות מתוארים בפרוטוקול זה באופן שלב אחר שלב, כולל שיטת osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO), הדמיית חתך אולטרה-דק טורי ותצוגת הדמיה.

Mitochondria are one of the most important organelles in the cell. They serve as the central hub of cellular bioenergetics and metabolism1,2 and play a critical role in cancer3. Pancreatic cancer (PC) is one of the most difficult cancers4 to treat due to its rapid spread and high mortality rate. Mitochondrial dysfunction, which is mainly caused by changes in the mitochondrial morphology3,5,6,7, has been linked to the disease mechanisms underlying PC8. Mitochondria are also highly dynamic, which is reflected by the frequent and dynamic changes in their network connectivity and cristae structure9. The reshaping of the cristae structure can directly impact the mitochondrial function and cellular state10,11, which are significantly altered during tumor cell growth, metastasis, and tumor microenvironment changes12,13.
In recent years, scientists have studied this organelle using EM observation14,15,16,17; for example, researchers have analyzed the mitochondrial dynamics using 3D reconstruction techniques6,7,18,19. The general concept and method for the 3D reconstruction of electron microscopy images were formally established as early as 196820 and involved combining electron microscopy, electron diffraction, and computer image processing to reconstruct the T4 phage tail. Up until now, electron microscopy 3D imaging technology has made significant advancements in terms of the image resolution21, degree of automation22, and processing volume23 and has been used on an increasingly broad scale in biological research, from the tissue level to the organelle ultrastructure level at the nanometer scale24. In recent years, electron microscopy 3D imaging has also become a promising technology for a wide range of applications25,26,27.
The growing attention on mitochondrial cristae particularly illustrates the essential requirements for ultrastructural volume imaging. Transmission electron microscopy (TEM) has been used to visualize samples collected on a copper grid (400 mesh)28, with the electron beam passing through the section. However, due to the limited range of the copper grid, it is impossible to fully image continuous slices of the same sample29. This complicates the study of target structures during TEM imaging. Additionally, TEM relies on time-consuming and error-prone manual tasks, including cutting and collecting multiple slices and imaging them sequentially21, so it is not adapted for ultrastructural reconstructions of large-volume samples23. At present, the high-resolution reconstruction of large-volume sample imaging is achieved through the use of specialized equipment, such as the TEM camera array (TEMCA)30 or two second-generation TEMCA systems (TEMCA2)31, which enable automated high-throughput imaging in a short time. However, this type of imaging does not have the advantage of being easy to obtain and universal due to the requirement for customized equipment.
Compared with TEM, the method for automatically generating thousands of serial volumetric images for large areas based on SEM32,33 enhances the efficiency and reliability of serial imaging and delivers higher z-resolutions34. For example, serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) and focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) have both made it possible to achieve the 3D reconstruction of ultrastructure with high speed, efficiency, and resolution35,36. However, it is inevitable that the block surface is mechanically shaved off by the diamond knife of the SBF-SEM or by milling with the focused ion beam of FIB-SEM33,37. Due to the destructiveness of the two methods to the samples, it is not possible to reconstruct the same target structure again for further analysis38,39,40. In addition, few studies have attempted to reconstruct the 3D organelle ultrastructure of cancer cells using EM to observe pathological changes12. For these reasons, in order to further elucidate the pathological mechanisms of cancer cells, such as pancreatic cancer cells, we propose a novel technology for the 3D reconstruction of serial section images using an ultramicrotome and a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) to analyze the mitochondrial ultrastructure at the cristae level; with this technology, high-resolution data can be acquired using an efficient and accessible method. The serial ultrathin sections made using an ultramicrotome can be semi-permanently stored in a grid case and reimaged multiple times, even after several years41. FE-SEM is highly valued as a tool in various research fields due to its ability to provide high-resolution imaging, high magnification, and versatility42. In an attempt to display the fine structure of organelles in 3D, the technique for producing serial 2D image stacks with useful resolution using back-scattered electrons produced by FE-SEM43,44 can also be used to achieve high-throughput and multi-scale imaging of target regions or their associated structures without special equipment45. The generation of charge artifacts directly affects the quality of the acquired images, so it is particularly important to keep the dwell time short.
Thus, the present study elaborates on the experimental procedures employed in this SEM technique to reconstruct the 3D structure of mitochondrial cristae46. Specifically, we show the process developed to achieve the semi-automatic segmentation of mitochondrial regions and digitize the 3D reconstruction using Amira software, which also involves making slice samples using the conventional OTO specimen preparation method44,47, completing the section collection using ultramicrotome slicing, and acquiring sequential 2D data by FE-SEM.

מחבר זרקור: טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב  

טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב

This project aims to review the anti-cancer effect of drugs by changing the structure at the subcellular nano-scale level, and establishing the link between organelle morphology and the cancer pathological mechanism. This technology combines traditional electron microscopy technology with three dimensional reconstruction technology without special equipment. Compared to other techniques, it can improve imaging efficiency and the reconstruction flexibility, and the real life reconstruction of target structures at any time.So it's highly easy and universal. This technology of three dimensional reconstruction of the continuous ultra-thin slides can repeatedly restore the real stereochemical without specific expensive equipment. It can be used for qualitative and quantitative analysis of all organelles at any time.It realizes the easy operation of observation.

במהלך תרבית תאים (איור 1A), חילקנו תחילה את תאי סרטן הלבלב לקבוצת ביקורת בתרבית עם מדיום תרבית שלם, קבוצה (1S,3R)-RSL348 (RSL3, מפעיל פרופטוזיס, 100 ננומטר), וקבוצת RSL3 (100 ננומטר) בתוספת פרוסטטין-149 (Fer-1, מעכב פרופטוזיס, 100 ננומטר). באמצעות שלבי הניסוי לעיל, מיקרוסק?...

Watch this Scientific Journal Video about A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells at JoVE.com

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשחזר כריסטה מיטוכונדריאלית כדי להשיג הדמיה תלת-ממדית בדיוק גבוה, ברזולוציה גבוהה ובתפוקה גבוהה.

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

פרויקט זה נועד לבחון את ההשפעה האנטי-סרטנית של תרופות על ידי שינוי המבנה ברמה הננומטרית התת-תאית, וביסוס הקשר בין מורפולוגיית אברונים לבין המנגנון הפתולוגי הסרטני. טכנולוגיה זו משלבת טכנולוגיית מיקרוסקופ אלקטרונים מסורתית עם טכנולוגיית שחזור תלת מימדית ללא ציוד מיוחד. בהשוואה לטכניקות אחרות, זה יכול לשפר את יעילות ההדמיה ואת גמישות השחזור, ואת שחזור החיים האמיתיים של מבני המטרה בכל עת.אז זה מאוד קל ואוניברסלי. טכנולוגיה זו של שחזור תלת מימדי של שקופיות דקות במיוחד מתמשך יכול שוב ושוב לשחזר את סטריאוכימי אמיתי ללא ציוד יקר ספציפי. זה יכול לשמש לניתוח איכותי וכמותי של כל האברונים בכל עת.הוא מבין את הפעולה הקלה של התצפית.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

1.1K Views.  School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University. פרויקט זה נועד לבחון את ההשפעה האנטי-סרטנית של תרופות על ידי שינוי המבנה ברמה הננומטרית התת-תאית, וביסוס הקשר בין מורפולוגיית אברונים לבין המנגנון הפתולוגי הסרטני. טכנולוגיה זו משלבת טכנולוגיית מיקרוסקופ אלקטרונים מסורתית עם טכנולוגיית שחזור תלת מימדית ללא ציוד מיוחד. בה...

Video: מחבר זרקור: טכניקה תלת מימדית להדמיה של שינויים אולטרה-מבניים מיטוכונדריאליים בתאי סרטן הלבלב  

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a three-dimensional (3D) perspective, is critical for mechanistic studies. Electron microscopy (EM) offers good imaging depth and allows for the reconstruction of high-resolution image stacks to investigate the ultrastructural morphology of cellular organelles even at the nanometer scale; therefore, 3D reconstruction is gaining importance due to its incomparable advantages. Scanning electron microscopy (SEM) provides a high-throughput image acquisition technology that allows for reconstructing large structures in 3D from the same region of interest in consecutive slices. Therefore, the application of SEM in large-scale 3D reconstruction to restore the true 3D ultrastructure of organelles is becoming increasingly common. In this protocol, we suggest a combination of serial ultrathin section and 3D reconstruction techniques to study mitochondrial cristae in pancreatic cancer cells. The details of how these techniques are performed are described in this protocol in a step-by-step manner, including the osmium-thiocarbohydrazide-osmium (OTO) method, the serial ultrathin section imaging, and the visualization display.

This protocol describes how to reconstruct mitochondrial cristae to achieve 3D imaging with high accuracy, high resolution, and high throughput.

Sample Preparation for the Three-Dimensional Reconstruction of Pancreatic Cancer Cell Mitochondria

To begin inoculate 2 million pan02 cells in 12 milliliters of DMEM, and incubate at 37 degrees Celsius and 95%humidity, 5%carbon dioxide, and 35%air. After 48 hours centrifuge the culture at 28 g for 2 minutes and discard the supernatant. Fix the cells by adding 1 milliliter of 2.5%glutaraldehyde in the 1.5 milliliter micro centrifuge tubes overnight at 4 degrees Celsius.The next day centrifuge the samples at 1006 g for five minutes and aspirate the fixative before rinsing the sample twice with 0.1 molar PBS. Subsequently, rinse the samples twice with double distilled water for 10 minutes each. Next, add a 50 microliter solution of 1%osmium tetroxide and 1.5%potassium ferrocyanide at a ratio of 1 to 1 and incubate at 4 degrees Celsius for 1 hour.Centrifuge and rinse the samples twice with 0.1 molar PBS and once with double distilled water. Then add 1 milliliter of 1%thiocarbohydrazide and incubate at room temperature for 30 to 60 minutes. After incubation centrifuge and discard the supernatant before rinsing the samples 4 times with double distilled water.Next, add 50 microliters of 1%osmium tetroxide and allow it to be fixed at room temperature for 1 hour. Centrifuge again and rinse the samples 4 times with double distilled water. Add 1 milliliter of 2%uranyl acetate and allow it to stain at 4 degrees Celsius overnight.After rinsing the samples with double distilled water add 1 milliliter of Walton solution and incubate at 60 degrees Celsius for one hour. After incubation rinse the cells 4 times with double distilled water before dehydration in a graded ethanol series for 10 minutes each. Then dehydrate twice in one milliliter of 100%acetone for 10 minutes each.Next, mix 200 microliters of acetone with Pon 812 epoxy resin at a ratio of 3 to 1, 1 to 1, and 1 to 3. And soak the samples in the resin at room temperature for 2, 4, and 4 hours respectively After respective incubation impregnate the samples overnight in 100%Pon 812 epoxy resin. The next day, transfer the specimens into a flat embedding mold and polymerize them in an oven at 60 degrees Celsius for 48 hours.After polymerization, using an ultra microtome, collect serially sliced strips of 70 nanometers thickness on the hydrolyzed silicon wafers and dry them in a 60 degrees Celsius oven for 10 minutes.

הכנת דגימה לשחזור תלת מימדי של מיטוכונדריה של תאי סרטן הלבלב

Image Acquisition and Three-Dimensional Reconstruction of Mitochondrial Cristae

Cut a conductive carbon tape and stick it between the silicon wafers mounted with pancreatic cell sections and SEM specimen stage. Next, set the FESEM accelerating voltage to two kilovolts with a working distance of four millimeters. In the top menu bar, click on the HL icon.Then, at low magnification, orient the first section of the target slice strips, and, again, click on the HL icon to switch to the high magnification mode. Collect an appropriate image for the structure of interest by adjusting the image brightness, contrast, and magnification. Next, select Project View, then Open Data, and import the image files to be analyzed into the software.Align the pictures by clicking on Align Slices and Edit. Then, in the lower left menu bar, adjust the Intensity Range value by modifying the image transparency. Select the Extract Sub-Volume module, and click the aligned data sets to fit the size of the overlapping portion of the whole stack.Next, under the segmentation sub-section, select Resample, then Segmentation, and click Save. Then, choose the threshold of the Magic Wand, and the size of the Brush Tool, to select the correct range. From the Selection menu, click on the Add icon to add the selected area.After completing the regional segmentation, generate an image file following the best results for the size of the object and picture resolution. Click on Crop Editor, and in the Virtual Slider box, enter the number six. Next, from the left dropdown menu, right-click on the gray area under the Project sub-section and select Generate Surface, then Create And Apply.In the generated file, using the Surface View module, create the surface structure and 3D representation. The 2D FESEM images reveal that in the control group, mitochondria were evenly distributed with regular cristae structures. In contrast, the RSL3 group showed shrunk mitochondria with increased membrane density and vague cristae structures.However, not all mitochondrial cristae degenerated in the RSL3 group as some remained intact. Compared to the RSL3 group, the inhibitor group had mostly intact cristae structures with only a few not apparent. The 3D images of the control group provided a more accurate view of the mitochondria and their cristae structures.The RSL3 group 3D images showed irregular and vacuolated mitochondria, while the inhibitor group displayed diverse cristae shapes. The quantification of mitochondrial alterations showed that the RSL3 group had significantly decreased mitochondrial length and volume, compared to the control group, while the inhibitor group showed intermediate results. RSL3 also caused mitochondrial dysfunction and altered cellular metabolism by changing mitochondrial morphology and triggering ferroptosis.