Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Fundação de Ciências Naturais da Província de Zhejiang (Z23H290001, LY19H280001); Subsídios da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (82274364, 81673607 e 81774011); bem como o Projeto de Pesquisa de Bem-Estar Público da Bolsa de Ciência e Tecnologia de Huzhou (2021GY49, 2018GZ24). Agradecemos a grande ajuda, suporte técnico e suporte experimental da Plataforma Pública do Centro de Pesquisa Médica, Academia de Ciências Médicas Chinesas, Universidade Médica Chinesa de Zhejiang.

1. Preparação do material
<ol><li>Cultivar 2 x 106 células Panc02 em 12 mL de meio DMEM (10% de soro fetal bovino e 100 U/mL de penicilina-estreptomicina), e manter a 37 °C e 95% de umidade em atmosfera de 5% de dióxido de carbono e 95% de ar por 48 h.</li>
	<li>Recolher células de Panc02, centrifugar a 28 x g durante 2 minutos e, em seguida, eliminar o sobrenadante. Certifique-se de que a amostra tem um tamanho adequado (1 x 107 células), caso contrário, as seguintes etapas de fixação e desidratação não funcionarão bem.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de glutaraldeído a 2,5% como fixador para fixar as células frescas de Panc02 nos tubos de microcentrífuga de 1,5 mL durante a noite a 4 °C. NOTA: As amostras precisam ser centrifugadas a 1.006 x g por 5 min em cada uma das etapas a seguir (etapas 1.3-1.11).</li>
	<li>Aspirar o fixador, enxaguar as amostras duas vezes com solução salina tamponada com fosfato 0,1 M (PBS) e, em seguida, enxaguar duas vezes com água bidestilada (ddH2O) à temperatura ambiente por 10 min cada.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de uma solução contendo tetróxido de ósmio a 1% (OsO 4) e ferrocianeto de potássio a 1,5% na proporção de 1:1 a4 °C durante 1 h. Em seguida, enxágue duas vezes com PBS 0,1 M por 10 min de cada vez e enxágue com ddH2O por mais 10 min.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de tiocarboidrazida (TCH) a 1%, incubar à temperatura ambiente por 30 min a 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes por 10 min de cada vez.</li>
	<li>Adicionar 50 μL de OsO4 a 1%, fixar à temperatura ambiente durante 1 h e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 min de cada vez.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de acetato de uranila a 2% a 4 °C durante a noite e, em seguida, enxaguar com ddH2O quatro vezes durante 10 minutos de cada vez.</li>
	<li>Adicionar 1 ml de solução de Walton (0,066 g de nitrato de chumbo dissolvido em 10 ml de solução-mãe de ácido aspártico 0,03 mol/L) a 60 °C para mais 1 h de incubação.</li>
	<li>Enxágue com ddH2O quatro vezes por 10 min cada vez e, em seguida, desidrate em uma série de álcool graduado por 10 min cada vez: álcool 50%, álcool 70%, álcool 80% e álcool 90% 1x e álcool 100% 2x. Em seguida, desidratar em acetona 100% duas vezes por 10 min cada vez. Use 1 mL de cada solução para a desidratação.</li>
	<li>Misturar 200 μL de acetona com a resina epóxi Pon 812 na proporção de 3:1, 1:1 e 1:3. Mergulhe a amostra em resina à temperatura ambiente por 2 h, 4 h e 4 h, respectivamente, e depois tome a resina epóxi 100% Pon 812 para impregnar durante a noite. OBS: Ao realizar as etapas de coloração e incorporação de resina, é importante operar em uma capela de fumaça, pois são substâncias tóxicas. Além disso, jalecos e luvas resistentes a solventes devem ser usados durante o experimento.</li>
	<li>Coloque os espécimes em um molde de incorporação e, em seguida, coloque em um forno a 60 °C por 48 h para polimerizar. Use a incorporação plana29 para reduzir a aparência de resina ao redor da amostra. Isso simplifica a instalação da amostra e diminui o impacto dos artefatos de carregamento na segmentação subsequente da imagem. OBS: Para posteriormente gerar uma superfície de corte horizontal, uma pequena quantidade de resina pode ser adicionada ao orifício do molde, tomando cuidado para não enchê-lo demais.</li>
	<li>Prepare wafers de silício primeiro lavando-os e depois hidrofilizando com uma solução concentrada de H 2 SO4/H 2O2por 30 min. Recolher em série tiras cortadas com uma espessura de 70 nm sobre os wafers de silício hidrofilizados utilizando um ultramicrótomo e secá-las num forno a 60 °C durante 10 min. NOTA: Capture lentamente a fatia à medida que a fatia flutua para a superfície dos wafers para evitar a perda ou deformação da fatia.</li>
</ol>2. Aquisição de imagens e reconstrução tridimensional
<ol><li>Antes de montar um wafer de silicone no palco, lave as seções com água destilada três vezes e seque-as ao ar. Corte uma fita de carbono condutora com o tamanho de 1 cm x 0,5 cm e cole-a entre o wafer de silício e o estágio da amostra de MEV para completar a configuração da amostra (Figura 2E).</li>
	<li>Ajuste o parâmetro de tensão de aceleração FE-MEV para 2 kV com uma distância de trabalho de 4 mm (Figura 3B e Tabela 1). NOTA: Para melhorar a relação sinal-ruído e reduzir o ruído na imagem, observe em baixas ampliações sempre que possível. À medida que o múltiplo aumenta, o alcance de varredura do MEV diminui, levando a um aumento no acúmulo de carga nas imagens.</li>
	<li>Clique no ícone H/L na barra de menu superior. Primeiro, em baixa ampliação, oriente a primeira seção das tiras de corte de destino e, em seguida, clique novamente na opção H/L (Figura 3A) para alternar para o modo de alta magnificação; Colete uma imagem apropriada para a estrutura de interesse ajustando o brilho, o contraste e a ampliação da imagem.</li>
	<li>Selecione Exibição de projeto > Dados abertos e importe os arquivos de imagem a serem analisados para o software.</li>
	<li>Alinhe as imagens clicando em Align Slices > Edit (Figura 4B) e ajuste o valor Intensity Range na barra de menus inferior esquerda modificando a transparência da imagem. Aqui, use uma estratégia de alinhamento semiautomático; Especificamente, por meio do alinhamento automático, faça com que as imagens se sobreponham a uma imagem anterior e, em seguida, execute o ajuste fino manual. NOTA: Neste trabalho, durante o processo de alinhamento, a imagem anterior foi utilizada como referência, e as operações mover e girar foram utilizadas para sobrepor ao máximo a estrutura alvo das duas imagens. Clicar em Alinhar par de fatias atual pode ajudar a alinhar as imagens automaticamente, mas pode ocorrer um extravio.</li>
	<li>Selecione o módulo Extrair Subvolume e recorte os conjuntos de dados alinhados para ajustar o tamanho da parte sobreposta de toda a pilha.</li>
	<li>Na subseção Segmentação (Figura 4C), selecione Resample > Segmentation > Save. Escolha o limite da Varinha Mágica e o tamanho da ferramenta Pincel para selecionar o intervalo correto. Aqui, novamente, adote um método de segmentação semiautomático usando primeiro a Varinha Mágica para selecionar automaticamente uma grande área adequada e, em seguida, use o Pincel para descrever com precisão os detalhes. NOTA: A Varinha Mágica pode ser aplicada a imagens de segmento com base nas diferenças óbvias na intensidade de pixel existentes entre a estrutura de interesse e as estruturas circundantes, alterando o valor de mascaramento e usando a Linha de Limite de Desenho. É incapaz de distinguir os artefatos de carregamento gerados durante a aquisição da imagem. Portanto, pode resultar em segmentação incorreta para as regiões-alvo. A ferramenta Pincel pode ser usada para segmentar manualmente para reconstruir com precisão as estruturas biológicas.</li>
	<li>Em Segmentação > Seleção, clique no ícone + para adicionar a área selecionada (Figura 4C).</li>
	<li>Repita o passo acima (2.8) para selecionar a mesma estrutura alvo em imagens diferentes até que a seleção esteja completa para reconstruir as microestruturas de interesse. NOTA: Durante os processos de remodelação mitocondrial, a seleção do objeto alvo deve ser realizada a partir da figura no meio de um grupo de imagens sequenciais. Se a área necessária for selecionada a partir da primeira ou da última imagem, o resultado da reconstrução não será capaz de apresentar uma visualização 3D completa.</li>
	<li>Após concluir a segmentação regional, gere o arquivo de imagem de acordo com os melhores resultados para o tamanho do objeto e a resolução da imagem. Clique em Crop Editor e digite o número 6 na caixa Virtual Slider (Figura 4C).</li>
	<li>No menu suspenso à esquerda, clique com o botão direito do mouse na área cinza sob a subseção Projeto e selecione Gerar superfície > Criar > aplicar. No arquivo gerado, use o módulo Surface View para criar a estrutura da superfície e a representação 3D.</li>
</ol>3. Quantificação
<ol><li>Clique em Remover pequenos pontos > aplicar (Figura 4D). Na subseção Project , clique com o botão direito do mouse na área cinza e selecione Label Analysis > Apply (Figura 4D).</li>
	<li>Personalize o nome da coluna e escolha um grupo de medidas. Selecione Volume3d e Length3d na caixa Medidas nativas. </li>
	<li>Clique no botão Aplicar no canto inferior esquerdo da tela. Copie os dados e o gráfico no software estatístico, como o GraphPad.</li>
</ol>

Técnica 3D para visualizar cristas mitocondriais em células cancerígenas pancreáticas

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

O método aqui apresentado é um guia passo-a-passo útil para a aplicação da técnica de reconstrução 3D, que envolve a aplicação de microscopia eletrônica e tecnologia de processamento de imagens para o empilhamento e segmentação de imagens tomográficas 2D geradas a partir de cortes ultrafinos seriados. Este protocolo destaca uma limitação das imagens 2D que pode ser abordada pela visualização 3D da ultraestrutura da organela, que tem como vantagens a forte reprodutibilidade das estruturas em nível de al...

As mitocôndrias são uma das organelas mais importantes da célula. Eles servem como o centro central da bioenergética e metabolismo celular 1,2 e desempenham um papel crítico no câncer3. O câncer de pâncreas (CP) é um dos cânceres mais difíceis de tratar4 devido à sua rápida disseminação e alta taxa de mortalidade. A disfunção mitocondrial, causada principalmente por alterações namorfologia mitocondrial3,5,6,7, tem sido associada aos mecanismos patológicos subjacentes aos CP8. As mitocôndrias também são altamente dinâmicas, o que se reflete nas mudanças frequentes e dinâmicas na conectividade de sua rede e estrutura decristas9. A remodelagem da estrutura das cristas pode afetar diretamente a função mitocondrial e o estadocelular10,11, que são significativamente alterados durante o crescimento das células tumorais, metástases e alterações no microambiente tumoral12,13.
Nos últimos anos, cientistas têm estudado essa organela utilizando a observação de EM14,15,16,17; por exemplo, pesquisadores analisaram a dinâmica mitocondrial utilizando técnicas de reconstrução 3D 6,7,18,19. O conceito geral e o método para a reconstrução 3D de imagens de microscopia eletrônica foram formalmente estabelecidos já em 196820 e envolveram a combinação de microscopia eletrônica, difração de elétrons e processamento de imagens por computador para reconstruir a cauda do fago T4. Até o momento, a tecnologia de imagem 3D por microscopia eletrônica tem feito avanços significativos em termos de resolução de imagem21, grau de automação22 e volume de processamento23 e tem sido usada em escala cada vez mais ampla em pesquisas biológicas, desde o nível tecidual até o nível de ultraestrutura da organela na escala nanométrica24. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica 3D também se tornou uma tecnologia promissora para uma ampla gama de aplicações25,26,27.
A crescente atenção às cristas mitocondriais ilustra particularmente os requisitos essenciais para a imagem volumétrica ultraestrutural. A microscopia eletrônica de transmissão (MET) tem sido utilizada para visualizar amostras coletadas em uma grade de cobre (400 mesh)28, com o feixe de elétrons passando pela seção. No entanto, devido ao alcance limitado da grade de cobre, é impossível obter imagens completas de cortes contínuos de uma mesma amostra29. Isso dificulta o estudo das estruturas-alvo durante a aquisição de imagens por TEM. Além disso, a ETM depende de tarefas manuais demoradas e propensas a erros, incluindo corte e coleta de múltiplos cortes e obtenção de imagens sequencialmente21, não sendo adaptada para reconstruções ultraestruturais de amostras de grande volume23. Atualmente, a reconstrução de alta resolução de imagens de amostras de grande volume é obtida por meio do uso de equipamentos especializados, como o TEMCA camera array (TEMCA)30 ou dois sistemas TEMCA de segunda geração (TEMCA2)31, que permitem imagens automatizadas de alto rendimento em um curto espaço de tempo. Entretanto, este tipo de imagem não tem a vantagem de ser de fácil obtenção e universal devido à necessidade de equipamentos personalizados.
Em comparação com o TEM, o método de geração automática de milhares de imagens volumétricas seriais para grandes áreas baseado no SEM 32,33 aumenta a eficiência e a confiabilidade das imagens seriais e oferece resoluções z mais altas34. Por exemplo, a microscopia eletrônica de varredura em bloco serial (SBF-SEM) e a microscopia eletrônica de varredura por feixe de íons focalizado (FIB-SEM) possibilitaram a reconstrução 3D de ultraestrutura com alta velocidade, eficiência e resolução35,36. Entretanto, é inevitável que a superfície do bloco seja raspada mecanicamente pelo bisturi de diamante do MEV-SBF ou pela fresagem com o feixe de íons focalizado do FIB-MEV33,37. Devido à destrutividade dos dois métodos para as amostras, não é possível reconstruir novamente a mesma estrutura alvo para análisesposteriores 38,39,40. Além disso, poucos estudos tentaram reconstruir a ultraestrutura da organela 3D de células cancerosas usando EM para observar alteraçõespatológicas12. Por estas razões, a fim de elucidar melhor os mecanismos patológicos de células cancerosas, como células cancerosas pancreáticas, propomos uma nova tecnologia para a reconstrução 3D de imagens de cortes seriados usando um ultramicrótomo e um microscópio eletrônico de varredura por emissão de campo (MEV-FE) para analisar a ultraestrutura mitocondrial em nível de cristas; Com essa tecnologia, dados de alta resolução podem ser adquiridos por meio de um método eficiente e acessível. As seções ultrafinas seriais feitas usando um ultramicrótomo podem ser armazenadas semi-permanentemente em uma caixa de grade e recriadas várias vezes, mesmo após vários anos41. A MEF-FE é altamente valorizada como ferramenta em vários campos de pesquisa devido à sua capacidade de fornecer imagens de alta resolução, alta magnificação e versatilidade42. Na tentativa de exibir a estrutura fina das organelas em 3D, a técnica para produzir pilhas de imagens 2D seriadas com resolução útil usando elétrons retroespalhados produzidos por FE-SEM 43,44 também pode ser usada para obter imagens de alto rendimento e multiescala de regiões alvo ou suas estruturas associadas sem equipamentos especiais 45. A geração de artefatos de carga afeta diretamente a qualidade das imagens adquiridas, por isso é particularmente importante manter o tempo de permanência curto.
Assim, o presente estudo elabora os procedimentos experimentais empregados nesta técnica de MEV para reconstruir a estrutura 3D das cristas mitocondriais46. Especificamente, mostramos o processo desenvolvido para alcançar a segmentação semiautomática das regiões mitocondriais e digitalizar a reconstrução 3D usando o software Amira, que também envolve a confecção de amostras de corte usando o método convencional de preparação de espécimes OTO44,47, completar a coleta de cortes usando fatiamento de ultramicrótomos e adquirir dados sequenciais 2D por MEV-FE.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>(1S,3R)-RSL3</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100218A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>SIGMA</td>
			<td>179124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amira</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aspartic acid</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-42068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s modified Eagle&#8217;s medium</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>Merck</td>
			<td>100983</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ferrostatin-1</td>
			<td>MCE</td>
			<td>HY-100579</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10437010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Field emission scanning electron microscope</td>
			<td>HITACHI</td>
			<td>SU8010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>A10500.22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lead nitrate</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-211724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>SANTA CRUZ</td>
			<td>sc-206008B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Panc02</td>
			<td>European Collection of Authenticated Cell Cultures&#160;</td>
			<td>98102213</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL505A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL302A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pon 812 Epoxy resin</td>
			<td>SPI CHEM</td>
			<td>GS02660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium ferrocyanide</td>
			<td>Macklin</td>
			<td>P816416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thiocarbohydrazide</td>
			<td>Merck</td>
			<td>223220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultramicrotome</td>
			<td>LEICA</td>
			<td>EMUC7</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Uranyl Acetate</td>
			<td>RHAWN</td>
			<td>R032929</td>
			<td>2020.2</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a three-dimensional technique for the visualization of mitochondrial ultrastructural changes in pancreatic cancer cells

A compreensão das características dinâmicas da ultraestrutura da organela celular, que não é apenas rica em informações desconhecidas, mas também sofisticada de uma perspectiva tridimensional (3D), é fundamental para estudos mecanísticos. A microscopia eletrônica (ME) oferece boa profundidade de imagem e permite a reconstrução de pilhas de imagens de alta resolução para investigar a morfologia ultraestrutural de organelas celulares mesmo na escala nanométrica; portanto, a reconstrução 3D está ganhando importância devido às suas vantagens incomparáveis. A microscopia eletrônica de varredura (MEV) fornece uma tecnologia de aquisição de imagens de alto rendimento que permite reconstruir grandes estruturas em 3D a partir da mesma região de interesse em cortes consecutivos. Portanto, a aplicação da MEV na reconstrução 3D em larga escala para restaurar a verdadeira ultraestrutura 3D de organelas está se tornando cada vez mais comum. Neste protocolo, sugerimos uma combinação de técnicas seriadas de corte ultrafino e reconstrução 3D para estudar cristas mitocondriais em células de câncer de pâncreas. Os detalhes de como essas técnicas são realizadas são descritos neste protocolo de forma passo a passo, incluindo o método ósmio-tiocarboidrazida-ósmio (OTO), a imagem de corte ultrafino seriada e o visor de visualização.

Mitochondria are one of the most important organelles in the cell. They serve as the central hub of cellular bioenergetics and metabolism1,2 and play a critical role in cancer3. Pancreatic cancer (PC) is one of the most difficult cancers4 to treat due to its rapid spread and high mortality rate. Mitochondrial dysfunction, which is mainly caused by changes in the mitochondrial morphology3,5,6,7, has been linked to the disease mechanisms underlying PC8. Mitochondria are also highly dynamic, which is reflected by the frequent and dynamic changes in their network connectivity and cristae structure9. The reshaping of the cristae structure can directly impact the mitochondrial function and cellular state10,11, which are significantly altered during tumor cell growth, metastasis, and tumor microenvironment changes12,13.
In recent years, scientists have studied this organelle using EM observation14,15,16,17; for example, researchers have analyzed the mitochondrial dynamics using 3D reconstruction techniques6,7,18,19. The general concept and method for the 3D reconstruction of electron microscopy images were formally established as early as 196820 and involved combining electron microscopy, electron diffraction, and computer image processing to reconstruct the T4 phage tail. Up until now, electron microscopy 3D imaging technology has made significant advancements in terms of the image resolution21, degree of automation22, and processing volume23 and has been used on an increasingly broad scale in biological research, from the tissue level to the organelle ultrastructure level at the nanometer scale24. In recent years, electron microscopy 3D imaging has also become a promising technology for a wide range of applications25,26,27.
The growing attention on mitochondrial cristae particularly illustrates the essential requirements for ultrastructural volume imaging. Transmission electron microscopy (TEM) has been used to visualize samples collected on a copper grid (400 mesh)28, with the electron beam passing through the section. However, due to the limited range of the copper grid, it is impossible to fully image continuous slices of the same sample29. This complicates the study of target structures during TEM imaging. Additionally, TEM relies on time-consuming and error-prone manual tasks, including cutting and collecting multiple slices and imaging them sequentially21, so it is not adapted for ultrastructural reconstructions of large-volume samples23. At present, the high-resolution reconstruction of large-volume sample imaging is achieved through the use of specialized equipment, such as the TEM camera array (TEMCA)30 or two second-generation TEMCA systems (TEMCA2)31, which enable automated high-throughput imaging in a short time. However, this type of imaging does not have the advantage of being easy to obtain and universal due to the requirement for customized equipment.
Compared with TEM, the method for automatically generating thousands of serial volumetric images for large areas based on SEM32,33 enhances the efficiency and reliability of serial imaging and delivers higher z-resolutions34. For example, serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) and focused ion beam scanning electron microscopy (FIB-SEM) have both made it possible to achieve the 3D reconstruction of ultrastructure with high speed, efficiency, and resolution35,36. However, it is inevitable that the block surface is mechanically shaved off by the diamond knife of the SBF-SEM or by milling with the focused ion beam of FIB-SEM33,37. Due to the destructiveness of the two methods to the samples, it is not possible to reconstruct the same target structure again for further analysis38,39,40. In addition, few studies have attempted to reconstruct the 3D organelle ultrastructure of cancer cells using EM to observe pathological changes12. For these reasons, in order to further elucidate the pathological mechanisms of cancer cells, such as pancreatic cancer cells, we propose a novel technology for the 3D reconstruction of serial section images using an ultramicrotome and a field emission scanning electron microscope (FE-SEM) to analyze the mitochondrial ultrastructure at the cristae level; with this technology, high-resolution data can be acquired using an efficient and accessible method. The serial ultrathin sections made using an ultramicrotome can be semi-permanently stored in a grid case and reimaged multiple times, even after several years41. FE-SEM is highly valued as a tool in various research fields due to its ability to provide high-resolution imaging, high magnification, and versatility42. In an attempt to display the fine structure of organelles in 3D, the technique for producing serial 2D image stacks with useful resolution using back-scattered electrons produced by FE-SEM43,44 can also be used to achieve high-throughput and multi-scale imaging of target regions or their associated structures without special equipment45. The generation of charge artifacts directly affects the quality of the acquired images, so it is particularly important to keep the dwell time short.
Thus, the present study elaborates on the experimental procedures employed in this SEM technique to reconstruct the 3D structure of mitochondrial cristae46. Specifically, we show the process developed to achieve the semi-automatic segmentation of mitochondrial regions and digitize the 3D reconstruction using Amira software, which also involves making slice samples using the conventional OTO specimen preparation method44,47, completing the section collection using ultramicrotome slicing, and acquiring sequential 2D data by FE-SEM.

Autor em destaque: uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerígenas pancreáticas  

Uma técnica tridimensional para a visualização de alterações ultraestruturais mitocondriais em células cancerosas pancreáticas

This project aims to review the anti-cancer effect of drugs by changing the structure at the subcellular nano-scale level, and establishing the link between organelle morphology and the cancer pathological mechanism. This technology combines traditional electron microscopy technology with three dimensional reconstruction technology without special equipment. Compared to other techniques, it can improve imaging efficiency and the reconstruction flexibility, and the real life reconstruction of target structures at any time.So it's highly easy and universal. This technology of three dimensional reconstruction of the continuous ultra-thin slides can repeatedly restore the real stereochemical without specific expensive equipment. It can be used for qualitative and quantitative analysis of all organelles at any time.It realizes the easy operation of observation.

Durante a cultura celular (Figura 1A), primeiramente dividimos as células de câncer de pâncreas em um grupo controle cultivado com meio de cultura completo, um grupo (1S,3R)-RSL348 (RSL3, um ativador de ferroptose, 100 nM) e um grupo RSL3 (100 nM) mais ferrostatina-149 (Fer-1, um inibidor de ferroptose, 100 nM). Através das etapas experimentais acima, o microscópio eletrônico de varredura adquiriu 38 (Figura Suplementar 1), 43 (Fi...

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Este protocolo descreve como reconstruir cristas mitocondriais para obter imagens 3D com alta precisão, alta resolução e alto rendimento.

Understanding the dynamic features of the cell organelle ultrastructure, which is not only rich in unknown information but also sophisticated from a ...

Este projeto tem como objetivo revisar o efeito anticancerígeno de fármacos, alterando a estrutura em escala nanocelular subcelular, e estabelecendo a ligação entre a morfologia da organela e o mecanismo patológico do câncer. Esta tecnologia combina a tecnologia tradicional de microscopia eletrônica com a tecnologia de reconstrução tridimensional sem equipamentos especiais. Em comparação com outras técnicas, pode melhorar a eficiência da imagem e a flexibilidade da reconstrução, e a reconstrução na vida real das estruturas-alvo a qualquer momento.Então é muito fácil e universal. Esta tecnologia de reconstrução tridimensional das lâminas ultrafinas contínuas pode restaurar repetidamente o estereoquímico real sem equipamentos específicos caros. Pode ser usado para análise qualitativa e quantitativa de todas as organelas a qualquer momento.Ele percebe a fácil operação da observação.

a-three-dimensional-technique-for-visualization-mitochondrial

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Three-Dimensional Technique for the Visualization of Mitochondrial Ultrastructural Changes in Pancreatic Cancer Cells

1.1K visualizações.  School of Pharmaceutical Science of Zhejiang Chinese Medical University. Este projeto tem como objetivo revisar o efeito anticancerígeno de fármacos, alterando a estrutura em escala nanocelular subcelular, e estabelecendo a ligação entre a morfologia da organela e o mecanismo patológico do câncer. Esta tecnologia combina a tecnologia tradicional de microscopia eletrônica com a tecnologia de reconstrução tridimensional sem equipamentos especiais. Em comparação com outras técnicas, pode melhorar a eficiência da imagem e a flexibilidade da reconstrução...

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