Bu çalışmanın yetiştirilmesi sırasında lisans asistanlarının, özellikle Regina Kurandina ve Rhea Smykalski'nin desteği için minnettarız. Carolyn Kalinowski, diğer Lepidoptera'larda metal toksisitesi ile ilgili literatürün derlenmesine yardımcı oldu. Bu çalışma, Minnesota Üniversitesi Ekoloji, Evrim ve Davranış Bölümü yaz araştırma bursu ile mümkün olmuştur.

Bu araştırma USDA APHIS izni P526P-13-02979 kapsamında gerçekleştirilmiştir.
1. Deneysel kelebeklerin toplanması
<ol><li>Bir hava böcek ağı ile yetişkin dişi kelebekleri yakalayın. Lahana beyazları genellikle nektar bitkileri ve konakçı bitkilerin (Brassicaceae familyasında) bulunduğu açık, rahatsız edici habitatlarda bulunur.<ol><li>Güneş dışarıda olduğunda ve sıcaklık sıcakken arama yapın. Dişileri hedeflemek için, yavaşça çırpınan, yere yakın olan ve yaprakları foretarsileriyle "davul" (tatmak) için bitkilere inen bireyleri arayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yumurta toplamak için dişileri kafeslere yerleştirin. NOT: Tarlada toplanan dişiler, ortalama olarak, bir veya iki erkekle çiftleşmiştir12 ve yakalandıktan kısa bir süre sonra verimli yumurtalar bırakmaya başlamalıdır. Vahşi yakalanan dişiler yumurtlamak ve çiftleşmek için doğal ışığa ihtiyaç duyarlar, bu nedenle kafesi bir seraya veya pencere kenarına yerleştirin.</li>
	<li>Yumurta toplamak için ev sahibi bir bitkiye sahip ev dişileri. NOT: Dişiler, yeşil lahana, turp, lahana, collards ve Arabidopsis dahil olmak üzere çeşitli konakçı bitkileri kabul edecek, ancak bitkilerin herhangi bir pestisitle muamele edilmediğinden emin olacaklardır.<ol><li>Çiçek suyu tüplerindeki lahana sapları gibi yaprak basıncını korumak için konakçı bitkileri saksılarda veya suyla dolu kaplarda sunun.</li>
		<li>Araştırmacı yumurta toplamak ve bunları doğrudan diyete aktarmak istiyorsa, önce plastik bir bardak suyun üstüne bir konakçı bitki yaprağı takmak için bir lastik bant kullanın ve daha sonra yaprağa dokunan kenar dişilerinin etrafına bir parça parafilm gerin (bkz.5).</li>
	</ol></li>
	<li>Kafesin ayrıca, örneğin saksı bitkisinin günlük sulanması veya özellikle kuru koşullarda bir havlunun ıslatılması yoluyla bağıl nemi yüksek tutacak bir şey içerdiğinden emin olun. Saksı bitkileri kafeste sulanırsa, kelebekler havuz suyuna sıkışabileceğinden, tencerenin altında bir havlu olduğundan emin olun.</li>
	<li>Kelebekleri, özellikle deneyimli bireylerle barındırılmışsa, kelebeklerin hızlı bir şekilde kullanmayı öğrendiği sarı bir sünger üzerinde sunulan% 10 seyreltilmiş bir bal suyu çözeltisi ile besleyin.<ol><li>Kelebekleri süngerlerden beslenmeye teşvik etmek için, özellikle bir su şişesiyle hafifçe püskürtüldükten sonra, genellikle hortumlarını çıkarmalarına neden olan doğrudan besleyiciye yerleştirin.</li>
		<li>Besleyiciyi kurmak için, önce sarı veya turuncu süngerleri iyice durulayın ve ardından bunları 60 mm plastik Petri kaplarına sığan küçük kareler halinde kesin. Besleyicileri günlük olarak değiştirin ve süngerleri hafif bir ağartıcı çözeltisinde temizleyin, ardından küf oluşumunu önlemek için iyice durulayın.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Yapay diyetler yapmak
<ol><li>İlk olarak, bir denemenin ilgili tarifini belirlemek için Tablo 1'deki tarifi veya diğer ilgili kaynakları kullanın. Odak türlere veya deneylere özgü gerekli değişiklikleri yapın. Malzemeleri tartarken izlenecek bir tarif yazdırın.</li>
	<li>Agar hariç tüm kuru malzemeleri tek bir kapta tartın. Bileşenlerin kendi depolama yerlerine geri konulduğundan emin olun, birkaç bileşenin 4 ° C'de depolandığını unutmayın Önceden tartılmış, kuru bileşen karışımını 5 mL keten tohumu yağı içeren bir karıştırıcıya yerleştirin.</li>
	<li>Her diyet grubu için aşağıda ayrıntılı olarak açıklanan adımları izleyin.<ol><li>15 g ince örgülü agarı, en az 1 L büyüklüğünde bir beherde 400 mL damıtılmış su ile karıştırın. Agar kaynamaya yakın olana kadar mikrodalgada, karışım boyunca ince kabarcıklar var, kaynamayı önlemek için karışımı her 30-60 saniyede bir karıştırın.</li>
		<li>Bu sıcak agar karışımına, vitamin karışımı ısıya duyarlı olduğundan, kuru bileşenlerle karıştırılması için uygun bir sıcaklığa getirmek için 400 mL musluk sıcaklığında damıtılmış su ekleyin.</li>
		<li>Agar karışımını karıştırıcıya ekleyin ve gerekirse karıştırıcının kenarlarını kazıyarak iyice karıştırın.</li>
	</ol></li>
	<li>Agar ısınırken, kenarları dokunacak şekilde tezgahın üzerine en az yetmiş dört onsluk diyet bardağı yerleştirin. Diyeti iyice karıştırdıktan sonra, karışımı karıştırıcıdan diyet bardaklarına dökün ve diyetin her bardağın tabanını kapladığından emin olun.</li>
	<li>Diyet soğuduktan sonra, kapakları bardakların üzerine yerleştirin, diyet bardaklarını diyet tipi ile etiketleyin, tepsilere istifleyin ve kullanıma kadar 4 ° C'de 1 aya kadar saklayın.</li>
</ol>3. Yapay diyetlerde transfer ve yetiştirme
<ol><li>Ev sahibi bitki, 24 ° C'lik bir iklim odasında bir ağ örtüsü ile 30 oz şarküteri bardaklarında kelebek yumurtası ile bırakır. 1 hafta sonra, bardakları kontrol edin - larvaların yumurtadan çıkmasını sağlayın ve birinci veya ikinci instar aşamasının sonlarında, yapay diyete transfer için iyi bir zaman.</li>
	<li>Larvaları bir boya fırçası ile yapay diyete aktarın, ağartıcı spreyi ile dezenfekte edin ve larva kapları arasında bir suyla durulayın. Her 4 oz bardağa üç larva aktarın. Yapay diyet enerji yoğundur ve larvaların yüksek yoğunluklarını destekleyebilirken, larvaları bardaklara paketlemekten kaçının, çünkü hastalıklar ve küf yüksek larva yoğunluğuna sahip bardaklara yayılabilir.</li>
	<li>Bardakları yanlarındaki plastik bir kutuya yerleştirin, böylece frass bardakların dibine ve diyetten uzağa düşerek küf ve hastalık riskini azaltır.<ol><li>Diyet bardaklarını düşük ila orta ışık seviyelerinde kontrollü sıcaklık koşullarında saklayın. Bardakları, şeffaf bardak kapaklarına göz atarak her 1-2 günde bir küf ve hastalık açısından izleyin.</li>
		<li>Küf veya hastalığı olan bardaklar, diğer bardaklara yayılmasını önlemek için karantinaya alınabilir veya dondurulabilir.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Yetişkinlerin ortaya çıkışı ve kullanımı
<ol><li>Larvaların yavrulaşmasına ve diyet bardaklarında ortaya çıkmasına izin verin. Yetişkinler ortaya çıktığında, işaretlemek için çıkarmadan önce kanatlarının sertleşmesi için birkaç saat verin. Yetişkin kelebekleri kanatlarını nazikçe kavrayarak temiz ellerle bardaklardan çıkarın, dört kanadı da vücutlarına daha yakın tutmanın daha kararlı bir tutuş olduğunu unutmayın.</li>
	<li>Kelebekleri işaretlemek için, kuru bireyleri baş ve göğüs kafesinden tutun ve arka kanatlarındaki bir sayıyı hafifçe işaretlemek için ince uçlu bir keskinlik kullanın.<ol><li>Kanat işaretleri ve genital organların bir kombinasyonunu kullanan seks bireyleri; Dişiler genellikle sırt ön kanatlarında iki siyah noktaya ve daha koyu, daha sarımsı arka kanatlara sahipken, erkeklerde genellikle daha parlak beyaz bir arka plan üzerinde sırt ön kanadında daha küçük bir siyah nokta vardır54.</li>
		<li>Bu renklenmenin bireysel ve mevsimsel farklılıklar gösterdiği göz önüne alındığında, karın özelliklerini kullanarak cinsiyeti doğrulayın - erkeklerin karınlarının distal ucunda iki toka ve genel olarak daha dar bir karın bölgesi varken, dişiler tek bir genital açıklığa sahiptir.</li>
	</ol></li>
	<li>Zarfı bir elinizle açarak, kelebeği başından ve göğüs kafesinden tutarak, zarfın içine kaydırarak ve diğer elinizle zarfın içinden kanatları tutarak yetişkinleri balmumu camsı zarflara aktarın.<ol><li>Dört kanadın da zarf içinde normal şekilde kapatıldığından emin olun.</li>
		<li>Kelebekleri deneyden önce 1 haftaya kadar soğuk koşullarda (5-6 ° C) saklayın, ancak buzdolabından çıkarıldığında alışmaları için en az 1 gün bekleyin.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Performans ölçümleri
<ol><li>Ölü bireylerdeki kanat özelliklerini ölçmek için, toraksı bir elinizde tutarak ve tabanındaki her bir kanadı çıkarmak için forseps kullanarak kelebeğin kanatlarını çıkarın. Kanatları düz bir ışık kutusuna yerleştirin ve daha sonraki ölçümler için fotoğraf çekin.</li>
	<li>Doğurganlık tahminlerini almak için, yetişkinleri çiftleşme kafeslerinde barındırın, erkeklerin üreme olgunlaşması için en az 1 gün ve çiftleşme için 1 gün izin verin. Diseksiyon yoluyla yumurta sayımı için belirlenen zaman noktalarında dişileri kurban edin veya konakçı bitkilerde her gün yumurta toplayın.</li>
	<li>Yumurta yüklerini tahmin etmek için, dişinin karnını çıkarın, 1x PBS tamponuna yerleştirin ve ventral taraf boyunca bir yarık kesin.<ol><li>İç kısımları kütikülden ayırmak için forseps kullanın, ardından yumurtalıkları bağırsaktan, trachae'den ve karnın diğer içeriğinden uzağa çekin.</li>
		<li>İki yumurtalığın her birindeki dört kıvrılmış yumurtalıkları açın, olgun, yumurta sarısı ve kabuklu yumurtaların olgunlaşmamış foliküllere geçtiği yerleri not edin. Genellikle 0-200 yumurta arasında değişen toplam olgun yumurtaların hesaplanmasına yardımcı olmak için bir sayaç kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Disseke edilmiş bir dişinin çiftleşme durumunu belirlemek için, bursa kopulatriksini açın ve içindeki spermatoforları ayırın. Spermatoforlar sindirildikçe, genellikle bir "kuyruk" geliştirirler ve birbirlerinin içine yuvalanırlar.</li>
</ol>6. Örnek olay incelemesi
NOT: Yetişkin dişi lahana beyaz kelebekleri, deneysel popülasyonları bulmak için 2014 yılında vahşi doğadan toplanmıştır. Yetişkin dişiler Davis, Kaliforniya yakınlarında doğmuştur (N = 8 kurucu kadın).
<ol><li>Kelebekleri barındırmak<ol><li>Dişileri bir serada doğal ışık altında "BugDorm" örgü kafeslerinde (61 cm x 61 cm x 61 cm) barındırın. Yumurtlama için konakçı bitki lahanasının (Brassica oleracea) organik bir yaprağını sağlayın.</li>
		<li>Kafeslerdeki nemi korumak için, günlük olarak sulanan, her kafesin içindeki bir havlunun üzerine yerleştirilen küçük bir saksı bitkisi (Cosmos) ekleyin.</li>
		<li>Yeni yumurtalı yaprakları kapakta delikli 473 mL plastik kaplara aktararak günlük olarak yumurta toplayın ve bir iklim odasına yerleştirin.</li>
		<li>Kelelongara, günlük olarak değiştirilen küçük bir Petri kabındaki sarı bir süngerden erişilebilen% 10'luk bir bal suyu çözeltisine (organik balın damıtılmış suyla seyreltilmesiyle yapılan) ad libitum erişimi sağlayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Yapay diyetlerin hazırlanması<ol><li>Daha önce geliştirilen Lepidoptera diyetlerinin modifikasyonlarını kullanarak lahana beyaz larvaları için yapay diyetler hazırlayın4. Bir diyet grubu 50 g buğday tohumu, 27 g kazein, 10 g selüloz, 24 g sakaroz, 15 g lahana unu, 9 g Wesson tuz karışımı, 12 g Torula mayası, 3.6 g kolesterol, 10.5 g Vanderzant vitamin karışımı, 1.1 g metil paraben, 1.5 g sorbik asit içeriyordu. 3 g askorbik asit ve 0.175 g streptomisin (bakınız Malzeme Tablosu).</li>
		<li>Birden fazla diyet partisi için kuru içerikleri önceden tartın (Tablo 1) ve metal çözeltilerle karıştırmak üzere ayrı partilere bölünmeden önce diyet türleri arasında homojenliği artırmak için iyice karıştırın.</li>
		<li>Kuru bileşenleri, keten tohumu yağı ve ilgili metal karışımı içeren bir karıştırıcıya yerleştirin. NOT: Keten tohumu yağı, geçmiş bir böcek diyeti sağlayıcısı tarafından satıldığı için bu deneyde kullanılmıştır. Şimdi, organik keten tohumu yağı sadece aynı bitkiden yapılan kullanılır, ancak ticari keten tohumu yağı sağlayıcıları olarak herhangi bir katkı maddesi içerme olasılığı daha düşüktür.</li>
		<li>Hazırlanan diyeti 118 mL (4 oz) plastik şarküteri bardaklarına dökün. Yapay diyetlere fokal metaller eklemek için çözünür metal tuzları kullanın. Bitkilerin metal içeriğinin (örneğin, nikel birikimi 55,56,57 veya bitkilerin yol kenarında kirlenmesi 58,59,60) ve diğer Lepidoptera'daki metallerin toleransının önceki gözlemlerine dayanan metal konsantrasyonlarınıhedefleyin 49,50,51.</li>
		<li>Yapay diyetlere eklemek için karşılık gelen miktarları almadan önce metal tuzlarını 500-1.000 mL damıtılmış suda çözün. Örneğin, 100 ppm nikel diyetini yapmak için, 100 mg / g Ni kuru ağırlık (yaklaşık 53 mg / g ıslak ağırlık) nihai diyet konsantrasyonu vermek üzere karıştırmadan önce yapay diyete 317.6 mL 1 M NiCl2 çözeltisi ekleyin. Bu miktar, endüktif olarak eşleşmiş plazma atomik emisyon spektroskopisine dayanan ortalama 109.6 ppm (Tablo 2) ölçülen konsantrasyona karşılık gelir. NOT: Metal seviyeleri, Minnesota Üniversitesi Araştırma Analitik Laboratuvarları tarafından altı örnekle tahmin edilmiştir.</li>
	</ol></li>
	<li>Bakım<ol><li>Konakçı bitkilerde hasat edilen yumurtaları iklim odalarında 14:10 fotoperiyotlarında 23 °C'de 7 gün bekletin. Bundan sonra, erken ikinci instar larvalarını yapay diyete aktarın.</li>
		<li>Transfer sırasında, larva partilerini diyet türüyle karıştırmaktan kaçınmak için larvaları belirli bir bitkiden dört diyet türüne eşit olarak bölün. Larvaları (N = toplam 346) 118 mL diyet kabı başına iki birey olarak aktarın, böylece aşırı kalabalıktan kaynaklanan hastalık insidansını azaltın ve yetişkinlerin sonunda kapanması için yeterli alana izin verin.</li>
		<li>Yetiştirme kaplarının kapaklarında delme delikleri (kapak başına üç). Bardakları yetiştirme için ayakkabı kutusu büyüklüğünde plastik kutulara yerleştirin, yetiştirme odasındaki konumun sistematik etkilerinden kaçınmak için farklı diyetler serpiştirilmiştir.</li>
		<li>Larva bardaklarını iklim odalarında, 14:10 fotoperiyotlarında 23 ° C'de saklayın (nemi %50-60 civarında tutmak için odanın dibinde su kutuları bulunur, bir ev nem sensörü ile izlenir). Bardakların küflenmesi durumunda (bu vaka çalışmasında yaklaşık sekiz toplam bardak), bardakları odadan çıkarın ve bu bireyleri deneyden çıkarın.</li>
		<li>Larvaların yetiştirme kaplarında yavrulaşmasına ve ortaya çıkmasına izin verin (N = toplam 162). NOT: Bu çalışmadaki yetiştirme koşulları için, yumurta toplamadan yetişkin ortaya çıkışına kadar geçen gelişim süresi ortalama 25-30 gün civarındadır (20-40 gün arasında değişmektedir, örneğin, 25,28).</li>
		<li>Pupalar yetişkinlerin ortaya çıkmasına yaklaştıkça, yeni kapatılmış bireyler için bardakları günlük olarak kontrol edin ve kurutulmuş kanatlı yetişkinleri çıkarın. İnce uçlu siyah bir sharpie kullanarak yetişkinleri arka kanatlarında karşılık gelen bireysel numaralarıyla (larva transferinde atanan) etiketleyin. Her bireyin cinsiyetini belirleyin ve sayıları ve ortaya çıkış tarihleri ile birlikte camsı bir zarf üzerinde işaretleyin. Yetişkin kelebekleri cam zarflara koyun ve sonraki işleme kadar -20 ° C'de saklayın. NOT: Gelişmekte olan yetişkinlerin küçük bir kısmı uçuş ve yetişkin sağkalımına müdahale edecek kanat deformiteleri göstermektedir (%5-%8); Bu bireyler bu deneyler için hayatta kalma analizlerinden hariç tutulur.</li>
	</ol></li>
	<li>Ölçüm ve veri analizi<ol><li>Hayatta kalmayı, ikinci instardan (tırtıllar diyete yerleştirildiğinde) yetişkin ortaya çıkışına kadar hayatta kalma olarak ölçün. NOT: Bu çalışma, farklı diyetlerde performans ölçümleri olarak hayatta kalma ve gelişim süresine odaklanmıştır.</li>
		<li>Gelişim süresini, diyetlere transfer ile iklim odasında yetişkinlerin ortaya çıkması arasındaki gün sayısı olarak ölçün.</li>
		<li>Veri analizi için, metal ve konsantrasyon arasındaki etkileşimleri içeren iki model kümesi çalıştırın. NOT: Her iki etkileşim de anlamlı olduğundan (F 2,194 = 4.56, p = 0.01 geliştirme süresi için ve X2 = 12.1, p = 0.002 sağkalım için), çalışma her metalin ayrı analizi ile devam etti.</li>
		<li>Sağkalımı analiz etmek için, metal dozunun (dört kategori olarak kabul edilir) kanatları tamamen bozulmadan yetişkinliğe kadar hayatta kalma üzerindeki etkilerini test etmek için her metal için ki-kare testleri yapın.</li>
		<li>Dozun önemli bir etkisi tespit edildiğinde, her seviyeyi kontrol diyetiyle karşılaştırmak için bir takip ki-kare uygulayın. Gelişim süresini analiz etmek için (transfer zamanından yetişkin olarak ortaya çıkana kadar), cinsiyetin gelişim süresi üzerindeki etkilerini test edin. NOT: Bu deneydeki herhangi bir metal için cinsiyetin gelişim süresi üzerinde bir etkisi olmadığı için (p > 0.10), modelde dikkate alınmamıştır.</li>
		<li>Dört konsantrasyonun geliştirme süresi üzerindeki etkisini test etmek için her metal için ayrı bir ANOVA çalıştırın. Ek olarak, bir performans etkisinin görüldüğü minimum konsantrasyonu belirlemek için kontrole göre her konsantrasyon için t-testleri yapın. NOT: Bu çalışmada tüm analizlerde JMP v16 kullanılmıştır. Tüm ham veriler Mendeley61'de mevcuttur.</li>
	</ol></li>
</ol>

Lahana Beyaz Kelebeklerinde Yapay Yetiştirme ve Ağır Metal Toleransı

Yazarların beyan edecekleri çıkar çatışmaları yoktur.

Bu araştırmada, lahana beyaz kelebekleri (Pieris rapae), ağır metal toksisitesindeki farklılıkları incelemek için yapay bir diyetle yetiştirildi. Bunu yaparken, bu çalışma, manipüle edilmesi kolay kelebek sisteminin yetiştirilmesi ve laboratuvar çalışmaları için genel yöntemler sunmaktadır. Bu tartışma ilk önce burada gözden geçirilen yöntemler hakkında daha genel soruları ele almakta, daha sonra yapay diyetin bileşenleri üzerindeki yansımalarla sonuçlanmadan önce bilimsel bulgularımızı gözden geçirmektedir.
Burada gözden geçirilen protokol, lahana beyaz kelebekleri için genel bir yetiştirme yönteminin adımlarını verir, ancak bu protokolde ince ayar yapılabilecek birçok nokta vardır. Örneğin, burada sunulan vaka çalışması beslenme için süngerler kullanırken, diğer araştırmacılar diş fitilleri ve ballı su ile doldurulmuş ipek çiçeklerle şanslıydılar5. Bu çalışma bal suyunu yiyecek olarak kullanırken, diğer araştırmacılar şeker çözeltilerini ve hatta Gatorade'yi kullandılar. Pupaların tartılması veya ortaya çıkması için başka koşullara taşınması gerekiyorsa (örneğin, diapause neden olmak ve 1 ay boyunca soğuk hava deposuna ihtiyaç duymak), araştırmacı ipek ataşmanlarını nemlendirmek için suyla püskürterek bardaklardan kolayca çıkarabilir ve tüy forsepsleri ile tutabilir, daha sonra çift taraflı bant kullanarak tekrar asabilir. Araştırmacılar, yetişkin kelebeklerin yetişkin davranışları için kafeslere ne zaman taşındığı konusunda daha fazla esnekliğe ihtiyaç duyarlarsa, buzdolabında birkaç hafta tutulabilirler, ancak beslenmeleri gerekir. Birkaç günde bir, kelebekler seyreltilmiş bir bal suyu çözeltisi ile beslenmek üzere çıkarılmalıdır. İç mekan aydınlatması altında, bu, hortumlarını yiyeceğe açmak için bir pim kullanılarak yapılabilir. Yetişkin performans tarafında, lahana beyaz kelebekleri üzerinde çok çeşitli fitness önlemleri alınabilir. Vücut büyüklüğü, belirli aşamalardaki larvaların, pupaların veya yetişkinlerin (kurban edilen veya cam zarflarda tutulan) ıslak veya kuru kütlesi olarak veya ImageJ programındaki kanat uzunluğunun ölçülmesiyle ölçülebilir (bkz. 12,24,25,28). Dişilerin yaşam boyu doğurganlığı, konakçı bitkilerde günlük yumurta toplama yoluyla ölçülebilir 25,69,70 ve belirli özelliklerin büyüklüğü bir performans metriği olarak ölçülebilir; Örneğin, beynin veya bireysel beyin bölgelerinin kütlesi veya hacmi 62,71,72 veya toraks veya uçuş kasının kütlesi veya protein içeriği 62,70. Son olarak, yetişkinler davranışsal çalışmalarda, diyet manipülasyonunun yiyecek arama veya yumurtlama seçimi üzerindeki etkisini inceleyen herhangi bir sayıda soruyu test etmek için kullanılabilir27,73.
Yetiştirme protokolü beklendiği gibi çalışmıyorsa, sorun gidermenin birkaç yönü vardır. İlk olarak, ışık seviyelerinin normal yetişkin davranışını ortaya çıkaracak kadar yüksek olup olmadığı sorulabilir. Pieris'in laboratuvara uyarlanmış hatları floresan ışığın altına yumurta bırakırken, vahşi tip çizgiler için çalışan tek yapay ışık güçlü geniş spektrumlu sera ışıklarıdır. Seralarda, pencere kenarlarında veya açık havada doğal ışık, çiftleşme ve yumurtlama davranışını ortaya çıkarmak için en iyi sonucu verir. İkincisi, yumurtalar yumurtadan çıkmıyorsa veya larvalar gelişimin erken dönemlerinde ölüyorsa, dikkate alınması gereken birkaç şey vardır. Ev sahibi bitki materyali organik olmalıdır, mağazalardan gelen "organik" bitkilerin bazen larvaları öldürebilecek kimyasallarla muamele edildiğini, bu nedenle kendi konakçı bitkilerini yetiştirmenin genellikle en iyisi olduğunu unutmayın. Ev sahibi kabul oranı daha düşükse, daha yüksek azot içeriğine sahip daha genç yapraklar denenebilir, bireysel yapraklar yerine saksı bitkileri sunulabilir ve dişilerin çiftleşmesi sağlanabilir. Dişiler tohumlama Brassica'yı, hatta 2 haftalık küçük filizleri bile kabul edecektir. Parafin yöntemi, yumurtaları farklı koşullara aktarmak için iyi çalışır, ancak kabul oranının bütün bitkilerden daha düşük olma eğiliminde olduğu belirtilmelidir. Üçüncüsü, diyetin tüm bileşenleri yüksek kalitede olmalı ve süresi dolmamalıdır. Keten tohumu yağı yıllık olarak değiştirilmeli ve buzdolabında24,25 saklanmalıdır. Buğday tohumu, vitamin karışımı ve antibiyotikler de serin tutulmalıdır. Dördüncüsü, diyet kabı kurulumunu değiştirmeyi düşünebilirsiniz. 1 oz'dan 15 oz'a kadar yetiştirme için herhangi bir sayıda tek kullanımlık plastik bardak tipi kullanılabilir. 4 oz'un yetişkinlerin ortaya çıkmasına izin vermek için iyi bir boyut olduğunu ve iklim odalarımıza güzel bir şekilde paketlendiğini bulduk. Kapaklara yerleştirilen delikler hava akışına izin verir, ancak çok fazla delik diyeti düşük nem koşullarında kurutabilir, bu nedenle bu sayının ayarlanması gerekebilir. Beşinci olarak, iklim odasındaki koşulların fincan koşullarıyla birlikte ayarlanması gerekebilir. Koşullar çok kuruysa, yumurtalı konakçı bitkiler larvalar transfer edilmeden önce kuruyabilir ve diyet içeren bardaklar kelebekler ortaya çıkmadan önce kuruyabilir. Öte yandan, koşullar çok ıslaksa, bardaklar küf ve hastalık barındırabilir. Araştırmacıların, bardaklardaki hava akışını, ağ kapakları veya kapaklardaki az ya da çok delikler kullanarak ayarlamaları gerekebilir. Diğer bir yaygın sorun, bardaklarda sıcaklık dalgalanmalarına ve yoğuşma birikmesine neden olacak kadar parlak oda ışıklarıdır; Dimmer ışıkları kullanmak larva yetiştiriciliği için kolay bir seçenektir.
Bu makaledeki araştırma sorularıyla ilgili olarak, bu çalışma lahana beyazlarının bakıra nikel veya çinkoya göre nispeten daha duyarlı olduğunu bulmuştur. Bakırın 50 ppm kadar düşük konsantrasyonlarda gelişme süresi (Şekil 3 ve Tablo 3) ve 500 ppm'de hayatta kalma üzerinde önemli olumsuz etkileri olmuştur (Şekil 4, Tablo 4). Buna karşılık, nikelin hayatta kalma üzerinde olumsuz bir etkisi yoktu (500 ppm'ye kadar; Şekil 3) veya 100 ppm'de geliştirme süresi üzerindeki olumsuz etkiler (Şekil 4). Lahana beyazları çinkoya karşı oldukça toleranslıydı, hayatta kalma etkileri sadece 1.000 ppm'de görüldü (Şekil 3) ve 100 ppm'den başlayan gelişim süresi üzerinde olumsuz etkiler (Şekil 4). Kelebek dokusu ve hardallardaki nispeten daha büyük çinko konsantrasyonlarına dayanarak (konakçı bitkileri; Şekil 1), çinkoya karşı nispeten daha büyük bir toleransın görülmesi bekleniyordu. Bununla birlikte, bakıra duyarlılık ve nikelin toleransı, kelebek dokusundaki çok düşük nikel seviyeleri (Şekil 1) ve bir mikro besin maddesi olarak bakırın gerekliliği göz önüne alındığında biraz beklenmedikti. Bu beklenmedik bulgular, bu metallerin diğer kelebeklerde ve güvelerde toleransı göz önünde bulundurulduktan sonra aşağıda tartışılmıştır.
Mevcut verileri diğer Lepidoptera'larda ölçülen metal duyarlılığı ile karşılaştırmak için, mevcut çalışmalardan elde edilen veriler, ağır metallerin sağkalımı olumsuz yönde etkilediği minimum konsantrasyon üzerine derlenmiştir 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68; Bu çalışmalar güvelere, özellikle haşere türlerine (Galleria mellonella, Lymantria dispar, Plutella xylostella, Spodoptera sp.) odaklanmıştır. Bu çalışmada ölçülen duyarlılık değerlerinin tümü, bu diğer türler için ölçülen aralığa yakındır (Şekil 5). Bununla birlikte, bu çalışmada nikel toleransının ölçüsü beklenenden daha yüksek görünmektedir - 500 ppm'de hayatta kalmanın önemli bir etkisi olmasa da, Pieris rapae üzerinde yapılan önceki çalışma, dokularında doğal olarak düşük seviyelere rağmen, nikel için çok yüksek bir tolerans (1.000 ppm56'dan başlayan önemli etkiler) bulmuştur (Şekil 1). Bu çalışmada bakır duyarlılığının ölçüsü de Lepidoptera çalışmaları için düşük uçta görünmektedir. Yapay bir diyetin kullanılması, göreceli metal duyarlılığının uygun ve kontrollü bir şekilde karşılaştırılmasına izin verirken, diyetin bileşenlerinin mutlak metal duyarlılığının ölçümünü değiştirebileceğini belirtmek önemlidir. Örneğin, diyetteki C vitamini metal kaynaklı oksidatif stresi dengeleyebilir74 veya diyetteki antibiyotikler mikropların metallerin işlenmesi üzerindeki etkilerini değiştirebilir75. Gelecekteki araştırmaların ilginç bir hattı, özellikle lepidopteran bağırsak mikroplarının 76,77 ve antioksidan özelliklere sahip olabilecek nektar bileşenlerinin fonksiyonel rolü hakkındaki sorular göz önüne alındığında, metal toksisitesi üzerindeki etkileri test etmek için bu tür diyet bileşenlerini sistematik olarak manipüle etmek olacaktır78. Ek olarak, türler arasında diyet gereksinimlerindeki çeşitlilik, spesifik karşılaştırmaları zorlaştırabilir ve yapay diyet tabanlı yöntemler, konakçı bitkilerin manipülasyonları ile tamamlanmalıdır.
Bu kelebekler özellikle nikele toleranslıdır ve bakıra karşı hassastır. Önceki araştırmalar, Pieridae tarafından tercih edilen bitkileri içeren hardal ailesindeki birçok bitkinin, otoburlara karşı bir savunma mekanizması olarak aşırı nikel biriktirdiğini belirtmiştir 55,56,63,79,80,81. Bu hiper birikim, bitki dokusunda 1.000 ppm'nin üzerindedir, bu da çoğu bitkide görülenden daha büyük büyüklük sıralarıdır (Şekil 1). Piris'in, daha önce spekülasyon yapıldığı gibi, bu tür nikel akümülatörleri tarafından geçmiş seçim nedeniyle nikel için özellikle yüksek bir toleransa sahip olması mümkündür26. Bakır, böcek diyetlerinde bir mikro besin maddesi olarak daha az sıklıkla çalışılırken, öncelikle kan besleyen böceklerde olmasına rağmen, üreme ve bağışıklıkta küçük bir rol oynadığına dair bazı kanıtlar vardır (örneğin, 82,83). Bakırın kelebeklerde diğer hayvanlardan daha az önemli bir fizyolojik rol oynaması mümkündür 84,85,86, bakırın kurşun, kadmiyum ve cıva gibi böcekler için bir kirletici madde olarak nasıl olabileceğini vurgulayan son çalışmalarla tutarlıdır (örneğin, 87,88,89). Piris'in düşük seviyelerde bakır kontaminasyonunu önlediği gösterilmiş olsa da90, bitkilerde bakırın hareketliliği (örneğin, yapraklara ve çiçeklere geçmek) de onu endişe verici bir metal kirletici olarak işaretlemiştir91.
Bu sonuçlar, bu metallerin lahana beyaz kelebeklerine göreceli toksisitesi hakkında ilginç veriler sağlarken, bu makale aynı zamanda bu güçlü sistemi yetiştirme yöntemlerinin ayrıntılı bir görsel gösterimi olarak genel olarak kullanılmasını amaçlamaktadır. Lahana beyazlarının kontrollü laboratuar deneylerinde 4,5 geri çekilmesi ve manipüle edilmesi kolaydır, bu da konakçı arama 6,7,8, yiyecek arama 9,10,11 ve cinsel seçilim12,13,14 çalışmalarını kolaylaştırır. Bu kelebekleri yapay bir diyetle destekleme yeteneği, karşılaştırmalar için ortak bahçe koşulları yaratmada ve besinleri, toksinleri ve hatta yeni konakçı bitkileri manipüle etmede anahtardır. Bununla birlikte, bu yapay diyetin mutlaka bu tür için en uygun yapay diyet olmadığını ve gelecekteki manipülasyonlarla geliştirilebileceğini belirtmek önemlidir. Örneğin, bu diyetteki tuz karışımı (ve diğer lepidopteran diyetleri) başlangıçta omurgalılar için geliştirilmiştir ve çoğu böceğin 92,93'e ihtiyaç duyduğundan daha yüksek kalsiyum seviyelerine sahiptir. Bu nedenle, yetiştirme çabalarımızdan bazıları daha düşük kalsiyum seviyelerine sahip özel tuz karışımları yapmıştır (örneğin, 62) ve diğerleri birçok böcek türü için daha uygun olabilecek "Beck'in tuz karışımı" nı kullanmaktadır94. Kendi manipülasyonlarımızda, kelebeklerin orijinal konsantrasyonlara kıyasla nispeten daha az buğday tohumu ve nispeten daha fazla selüloz ile daha iyi performans gösterdiğinibulduk4. Daha fazla dikkat edilmesi gereken bir alan, diyetteki lipit kaynağı ve konsantrasyonudur. Örneğin, geçmiş çalışmalar, keten tohumu yağından (bu çalışmada kullanılan) fosfolipitlere kaymanın, Pieris'in yapay diyetlerde çiftleşme oranlarını ve büyüme oranlarını artırdığını göstermiştir95. Yapay diyetlerde spesifik yağ asitlerinin takviyesinin ek olumlu etkileri olabilir96,97. Pieris98,99'un yapay diyetini optimize etmek, beslenme ekolojisi100,101,102, evrimsel ekoloji ve ekotoksikoloji hakkında ilginç soruları ele almak için fırsatlar yaratır. Bu yapay diyet yaklaşımları, araştırmacıların bilişsel evrimde spesifik lipitlerin rolü103, toksinlere ön adaptasyon28, kirleticilerin toksisitesini azaltan diyet bileşenleri 104 veya besinler arasındaki stokiyometrik etkileşimler105 hakkındaki soruları ele almalarını sağlar.

Küçük lahana beyaz kelebeği (Pieris rapae, bundan böyle "lahana beyazı" olarak anılacaktır), lahana, brokolive kanola 1,2,3 gibi hardal bitkilerinin kozmopolit bir haşere türüdür. Aynı zamanda, lahana beyazı biyoloji araştırmaları için güçlü bir sistemdir ve kontrollü laboratuvar deneylerinde kolayca yetiştirilebildikleri ve manipüle edilebildikleri için yaygın olarak kullanılan bir kelebek modelidir 4,5. Lahana beyaz kelebekleri üzerine yapılan araştırmalar, konakçı arama 6,7,8, nektar kaynak kullanımı9,10,11, eş seçimi ve cinsel seçilim 12,13,14, kanat kalıbı gelişimi ve evrimi15,16,17 ve yeni ve değişen yanıtlar açısından kritik bilgiler sağlamıştır ortamlar18,19. Bu içgörülerin çoğu, lahana beyazlarının yapay diyetlerle yetiştirilebileceği gerçeğine dayanmaktadır 4,20,21, kötü beslenme koşullarını yansıtmak için tam olarak manipüle edilebilir 22,23, ekolojik olarak ilgili kirletici seviyeleri 24,25,26,27 veya yeni konakçı bitkilere geçişler28,29. Bu çalışma, laboratuvarda yapay bir diyetle lahana beyaz kelebeklerinin yetiştirilmesi için temel yöntemleri ve larvaların ve yetişkinlerin temel performans ölçümlerini göstermek için ağır metallere maruz kalma üzerine bir deney kullanmaktadır. Bu yöntemlerin birçok yönü, yapay bir diyetle yetiştirilebilen diğer kelebekler30,31 ve güveler32,33,34 için geçerlidir.
Bu yazıda, lahana beyaz kelebek yetiştiriciliğinin genel yöntemlerini göstermek için metal toleransı üzerine bir deney kullanılmıştır. Ağır metaller, insan ürünlerinin bozulmasından, endüstriyel süreçlerden ve pestisitlerde, boyalarda ve diğer ürünlerde tarihsel kullanımdan kaynaklanan eski kontaminasyondan kaynaklanan yaygın bir antropojenik kirleticidir 35,36,37,38. Kurşun, bakır, çinko ve nikel de dahil olmak üzere birçok ağır metal, topraktan ve sudan bitki dokusuna 39,40,41,42 hareket edebilir ve tozdaki metaller bitki yaprakları üzerinde43,44,45 oranında birikebilir ve bu da fitofajöz böcek larvalarına birden fazla maruz kalma yoluna neden olur. Yaşamın erken dönemlerinde ağır metale maruz kalmanın hayvan gelişimi üzerinde, özellikle sinir dokusu üzerinde olumsuz etkileri olabilir ve yüksek seviyeler ölümcül olabilir 35,36,46,47,48. Bir dizi çalışma, metal maruziyetinin hem zararlılar hem de faydalı böcekler dahil olmak üzere gelişmekte olan böcekler üzerindeki olumsuz etkilerini göstermiştir 49,50,51. Çok sayıda ağır metal kirletici madde ve bunların sıklıkla insan ortamlarında birlikte meydana gelmeleri52, araştırmacıların gelişmekte olan böcekleri çevresel etkilerini anlamak ve hafifletmek için farklı metallerin farklı seviyelerine ve kombinasyonlarına maruz bırakabilecekleri hassas laboratuvar yöntemlerine ihtiyaç duyulduğu anlamına gelir.
Bu çalışma, ortak metallerin lahana beyazının hayatta kalması ve gelişimi üzerindeki etkilerini, insan ortamlarında üç yaygın kirletici olan bakır (Cu), çinko (Zn) ve nikel (Ni) üzerine odaklanarak karşılaştırmaktadır. Örneğin, kırsal Minnesota yol kenarlarından gelen çatallar 71 ppm Zn, 28 ppm Cu ve 5 ppm Ni53 içerir. Bu deney, lahana beyaz kelebeklerinin yapay diyetlerindeki bu metallerin seviyelerini, çevrede görülen seviyelere karşılık gelen ve aşan seviyelerde manipüle eder. Bu metallerin nispi toksisitesini karşılaştırmak için yapay bir diyet kullanılır ve lahana beyazlarının, fizyolojilerinin ayrılmaz bir parçası olmayan metal kirleticilere (nikel), enzimlerde ve dokularda (bakır ve çinko; Şekil 1). Bu metin boyunca, bu önemli kelebek modeli sisteminin yetiştirme ve araştırma yöntemlerini göstermek için metodolojik ayrıntılar ve beraberindeki video görselleştirmeleri sağlar.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-L Pyrex beaker</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>07-250-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>500 mL graduated cylinder</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-007-43</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60-mm plastic petri dish lid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>08-757-100B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>6015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blender</td>
			<td>Amazon - Ninja Store</td>
			<td>BL610 Professional</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cabbage Flour</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1086</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Casein</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Celluose</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>3425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholsterol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C3045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cups for rearing (4 oz)</td>
			<td>Wasserstrom</td>
			<td>6094583</td>
			<td>purchase with matching lids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine Mesh Agar</td>
			<td>Sigma</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flaxseed Oil</td>
			<td>amazon</td>
			<td>B004R63VI6</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Floral water tubes, 2.8 x 0.8inch</td>
			<td>Amazon - Yimaa Direct</td>
			<td>B08BZ969DK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glassine envelopes (1 3/4 x 2 7/8 INCHES)</td>
			<td>Amazon - Wizard Coin Supply</td>
			<td>B0045FG90G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesh Cages (15.7 x 15.7 x 23.6&#34;)</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07SK6P94S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl Paraben</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>7685</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ohaus Portable Scale</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-112-228</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Organic Honey</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07DHQQFGM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photo studio portable lightbox</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B07T6TNYJ1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic bin, shoebox size</td>
			<td>Amazon</td>
			<td>B09L3B3V1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic disposable transfer pipets</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-680-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sorbic Acid</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S1626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spatulas</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-357Q</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S9137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Target</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Torula Yeast</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>1720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vanderzant vitamin mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Weigh boats</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>01-549-750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wesson Salt Mix</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>F8680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wheat Germ</td>
			<td>Frontier</td>
			<td>G1659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wooden handled butterfly net, 12&#34; hoop</td>
			<td>Amazon - Educational Science</td>
			<td>B00O5JDLVC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Yellow sponges</td>
			<td>Amazon-Celox</td>
			<td>B0B8HTHY5B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rearing the cabbage white butterfly (pieris rapae) in controlled conditions: a case study with heavy metal tolerance

Lahana beyaz kelebeği (Pieris rapae), uygulamalı haşere kontrol araştırması ve davranışsal ve beslenme ekolojisindeki temel araştırmalar için önemli bir sistemdir. Lahana beyazları, yapay bir diyetle kontrollü koşullarda kolayca yetiştirilebilir ve bu da onları kelebek dünyasının model bir organizması haline getirir. Bu yazıda, bu türün yetiştirilmesi için temel yöntemleri göstermek için ağır metal maruziyetinin manipülasyonu kullanılmıştır. Genel protokol, kelebeklerin tarlada nasıl yakalanabileceğini, sera kafeslerine yumurta bırakmaya nasıl teşvik edilebileceğini ve larva olarak yapay diyetlere nasıl aktarılabileceğini göstermektedir. Yöntemler, kelebeklerin çeşitli araştırma soruları için nasıl işaretlenebileceğini, ölçülebileceğini ve çalışılabileceğini göstermektedir. Temsili sonuçlar, bileşenlere göre değişen yapay diyetlerin, bir kontrol diyetine göre kelebek performansını değerlendirmek için nasıl kullanılabileceği hakkında bir fikir vermektedir. Daha spesifik olarak, kelebekler nikele karşı en toleranslı ve bakıra en az toleranslıydı, ortada bir yerde çinko toleransı vardı. Bazı hardal konakçı bitkilerde nikel hiper-birikimi ve böceklerde bakırın daha önce takdir edilenden daha toksik olabileceğine dair son kanıtlar da dahil olmak üzere bu sonuçlar için olası açıklamalar tartışılmaktadır. Son olarak, tartışma, gelecekteki araştırmaların bu çalışmada kullanılan yapay diyeti nasıl daha da optimize edebileceğini düşünmeden önce, protokoldeki varyasyonları ve bu yöntemlerin sorunlarını giderme talimatlarını gözden geçirmektedir. Genel olarak, yapay diyetlerde lahana beyazlarının yetiştirilmesi ve ölçülmesi hakkında ayrıntılı bir video genel bakışı sağlayarak, bu protokol bu sistemi çok çeşitli çalışmalarda kullanmak için bir kaynak sağlar.

The small cabbage white butterfly (Pieris rapae, hereafter &#34;cabbage white&#34;) is a cosmopolitan pest species of mustard crops, such as cabbage, broccoli, and canola1,2,3. At the same time, the cabbage white is a powerful system for research in biology and a commonly used butterfly model, as they can be easily reared and manipulated in controlled lab experiments4,5. Research on cabbage white butterflies has provided critical insights with respect to host searching6,7,8, nectar resource use9,10,11, mate choice and sexual selection12,13,14, wing pattern development and evolution15,16,17, and responses to novel and changing environments18,19. Many of these insights rely on the fact that cabbage whites can be reared on artificial diets4,20,21, which can be precisely manipulated to reflect poor nutritional conditions22,23, ecologically relevant pollutant levels24,25,26,27, or transitions to novel host plants28,29. The present study uses an experiment on exposure to heavy metals to illustrate basic methods for rearing cabbage white butterflies on an artificial diet in the laboratory and key performance measures of larvae and adults. Many aspects of these methods apply to other butterflies30,31 and moths32,33,34 that can be reared on an artificial diet.
In this paper, an experiment on metal tolerance is used to illustrate the general methods of rearing cabbage white butterflies. Heavy metals are a common anthropogenic pollutant stemming from the degradation of human products, industrial processes, and legacy contamination from historical use in pesticides, paints, and other products35,36,37,38. Many heavy metals, including lead, copper, zinc, and nickel, can move from soil and water into plant tissue39,40,41,42, and metals in dust can be deposited on plant leaves43,44,45, resulting in multiple routes of exposure to phytophagous insect larvae. Heavy metal exposure early in life can have negative effects on animal development, especially on neural tissue, and high levels can be lethal35,36,46,47,48. A number of studies have shown the negative effects of metal exposure on developing insects, including both pests and beneficial insects49,50,51. The large number of heavy metal pollutants, and the fact that they often co-occur in human environments52, means that precise lab methods are needed in which researchers can expose developing insects to different levels and combinations of diverse metals to understand and mitigate their environmental effects.
The present work contrasts the impacts of common metals on cabbage white survival and development, focusing on copper (Cu), zinc (Zn), and nickel (Ni), three common pollutants in human environments. For instance, forbs from rural Minnesota roadsides contain up to 71 ppm Zn, 28 ppm Cu, and 5 ppm Ni53. This experiment manipulates the levels of these metals in artificial diets of cabbage white butterflies at levels corresponding to, and exceeding, the levels seen in the environment. An artificial diet is used to contrast the relative toxicity of these metals, predicting that cabbage whites would be more sensitive to metal pollutants that are not an integral part of their physiology (nickel) relative to those that occur, albeit at small levels, in enzymes and tissue (copper and zinc; Figure 1). Throughout, this text provides methodological details and accompanying video visualizations to illustrate the rearing and research methods of this important butterfly model system.

Yazar Gündemi: Lahana Kelebeklerinin Kentsel Kirleticilere Toleransının Araştırılması 

Lahana Beyaz Kelebeğinin (Pieris rapae) Kontrollü Koşullarda Yetiştirilmesi: Ağır Metal Toleranslı Bir Vaka Çalışması

In this study, we're interested in understanding how organisms deal with anthropogenic environments like cities, roadsides, and crop fields. We use cabbage white butterflies as a system because they're easy to manipulate experimentally. For instance, we're studying genetic variation intolerance to urban pollutants.We collect samples from different locations and populations to study variation over species or space. Nets, coolers, and envelopes are our main tools in the field. Butterfly traits are measured by microscopy and ICP-MS is the best method to measure heavy metal concentrations in small samples.One of the current experimental challenges is studying the variation across species and their developmental adjustments to human environments. The main difficulty lies in rearing diverse species under controlled experimental conditions. While cabbage white butterflies are easy to raise, finding suitable analogous diets for 10 or 20 different species that feed on various plants presents a significant challenge from an experimental perspective.We're interested in mitigating exposure to urban toxins, the ecological interventions that could decrease the toxicity of heavy metals and other urban pollutants, such as microplastics, are being explored. Additionally, we aim to investigate how to design pockets of habitat within city spaces to encourage the health of plants and animals living there, including humans.

Genel bakış Yapay diyet, bazı diyet bileşenlerinin kelebek performansı üzerindeki etkilerini test etmek için standart koşullarda lahana beyaz kelebeklerini yetiştirmek için kullanılabilir. Bu çalışmada, kirli alanlarda yetişen konakçı bitkilerde bulunan farklı metallerin toksisitesini incelemek için yapay diyetler kullanılmıştır (Şekil 1). Larvalar, üç farklı metalin artan konsantrasyonlarını içeren diyetlerde yetiştirildi (Şekil 2; protokolün 6. bölümünde sunulan spesifik metodolojik detaylar). Kelebeğin hayatta kalması ve gelişimi, bakır ve çinkodan daha fazla etkilenmiş ve nikelden en az etkilenmiştir (Şekil 3 ve Şekil 4), yapay diyetlerde yetiştirilen kelebekler ve güvelerle yapılan diğer çalışmalarla karşılaştırılabilir bir duyarlılığa sahiptir (Şekil 5).
Beka Kelebek larvaları, her metal tipinin konsantrasyonda üç seviyede değiştiği bakır, nikel, çinko veya kontrol içeren yapay diyetlere aktarıldı (Tablo 3). Artan bir toksin dozunda larvaların temsili bir görüntüsü Şekil 2'de gösterilmiştir. Metal konsantrasyonunun nikel için hayatta kalma üzerinde bir etkisi yoktu, ancak hem bakır hem de çinko için anlamlı bir etki vardı (Tablo 3 ve Şekil 3). Post-hoc ki-kare karşılaştırmaları, çinkonun sadece en yüksek çinko seviyesinde kontrol diyetine göre sağkalımda bir düşüş gösterdiğini göstermiştir (1.000 ppm, post-hoc karşılaştırma X12 = 8.41, p = 0.004; Şekil 1). Bakır ayrıca sağkalımda sadece kullanılan en yüksek seviyelerde (500 ppm, X12 = 7.00, p = 0.008) önemli bir düşüş gösterdi, ancak en düşük iki seviyede (50 ppm ve 100 ppm; Şekil 3).
Geliştirme süresi Bakır ve çinko konsantrasyonunun gelişme süresi üzerinde anlamlı bir etkisi vardı (Tablo 4 ve Şekil 4). Bakır konsantrasyonu arttıkça, 50 ppm'den başlayan kontrolden önemli bir sapma ile gelişme süresinde bir artış olmuştur (p = 0.027; Şekil 3). Çinko konsantrasyonu arttıkça, 100 ppm'den başlayan kontrolden önemli bir sapma ile gelişme süresinde bir artış oldu (p = 0.03; Şekil 4). Nikelin daha uzun gelişim sürelerine yol açması için artan bir eğilim vardı (p = 0.08; Tablo 4) ve her diyetin kontrol ile karşılaştırılması 100 ppm'den başlayarak anlamlı etkiler göstermiştir (p = 0.022; Şekil 4).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig01.jpg"> Şekil 1: Kelebek dokusunda ve konakçı bitkilerde gözlenen fokal metal seviyeleri. (62'den gelen veriler.) Bakır, nikel ve çinko seviyeleri, Pieris kelebek dokusu (laboratuarda bok choy üzerinde yetiştirilir) ve vahşi toplanan hardallar (Bertorea sp.) için gösterilmiştir. Otomobiller, yüksek trafikli yollar boyunca bitki yapraklarında görülen seviyeleri gösterir53. Bu çalışmada kullanılan yapay diyetlerdeki metal düzeyleri Tablo 1'de bildirilmiştir; noktalar ortalamaları, hata çubukları ise standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig01large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig02.jpg"> Şekil 2: Aynı gün bir toksin konsantrasyonunun arttırıldığı yapay diyetlere aktarılan lahana beyaz larvalarının görüntüsü. Bu görüntü, bir doz-yanıt çalışmasından larvaları göstermektedir (toksik bitki Aristolochia için kurutulmuş bitki materyali kullanılarak 28'de sunulmuştur). Fotoğraf: ESR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig02large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig03.jpg"> Şekil 3: Artan konsantrasyonlardaki metal diyetlerde hayatta kalmadaki varyasyon. Yıldız işaretleri, kontrol diyetine göre sağkalımda önemli sapma olduğunu gösterir. Diyetlerdeki kesin metal konsantrasyonları Tablo 2'de listelenmiştir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig03large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig04.jpg"> Şekil 4: Metal konsantrasyonunun gelişim süresi üzerindeki etkileri. Yıldız işaretleri, kontrole göre önemli bir farkın olduğu en düşük metal konsantrasyonunu gösterir (bir t-testi kullanarak). Diyetlerdeki kesin metal konsantrasyonları Tablo 2'de listelenmiştir. Noktalar araçları temsil eder ve hata çubukları standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig04large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65383/65383fig05.jpg"> Şekil 5: Diğer Lepidoptera'lardaki metal toleransının özeti. Mevcut11 çalışmadan 49,50,51,56,63,64,65,66,67,68 elde edilen kompozit sağkalım verileri gösterilmiştir. Yanıt değişkeni, sağkalım üzerindeki olumsuz etkilerin ilk görüldüğü metal konsantrasyonunun seviyesidir (ppm cinsinden). Kelebekler, nikel için tolerans değerlerinin bu çalışmada ölçülenlerden daha yüksek olduğunu belirterek bu çalışmanın sonuçlarını göstermektedir. Noktalar araçları temsil eder ve hata çubukları standart hatayı temsil eder. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65383/65383fig05large.jpg" target="_blank">Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Malzeme</td>
			<td>Farklı tartım</td>
			<td>g</td>
			<td>Ml</td>
		</tr><tr><td>Buğday Tohumu</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Selüloz</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Lahana unu</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kazein</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>27</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sakaroz</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>24</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Wesson Tuz Karışımı</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>9</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Torula Mayası</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>12</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Kolesterol</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>3.6</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Vitamin Karışımı</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>10.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Metil Paraben</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>0.75</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Sorbik Asit</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>1.5</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Askorbik Asit</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>3</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Streptomisin</td>
			<td>kuru malzemeler</td>
			<td>0.175</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>Keten tohumu yağı</td>
			<td>Islak malzemeler</td>
			<td></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>Ağar</td>
			<td>Arjantin</td>
			<td>15</td>
			<td></td>
		</tr></tbody></table>Tablo 1: Yapay diyet tarifi. Gösterilenler, bir lahana beyaz kelebek diyeti grubundaki bileşenlerin ağırlıklarıdır (ve hacimleridir). Kuru bileşenler (ve keten tohumu yağı) agar karışımından ayrı olarak hazırlanır (400 mL kaynar suda çözülür, daha sonra 400 mL oda sıcaklığında su ile daha soğuk bir sıcaklığa getirilir).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Diyet türü</td>
			<td>Bakır (ppm)</td>
			<td>Nikel (ppm)</td>
			<td>Çinko (ppm)</td>
		</tr><tr><td>Bakır-"100 ppm"</td>
			<td>96.1</td>
			<td>1.75</td>
			<td>69.9</td>
		</tr><tr><td>Nikel-"100 ppm"</td>
			<td>7.29</td>
			<td>109.6</td>
			<td>68.9</td>
		</tr><tr><td>Çinko-"100 ppm"</td>
			<td>7.96</td>
			<td>1.06</td>
			<td>186.2</td>
		</tr><tr><td>Çinko-"500 ppm"</td>
			<td>6.51</td>
			<td>1.16</td>
			<td>708</td>
		</tr><tr><td>Kontrol</td>
			<td>5.89</td>
			<td>0.59</td>
			<td>59.3</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 2: Diyetlerde metallerin ölçümleri. Çalışmada kullanılan yapay diyetlerin bir alt kümesindeki ortalama bakır, nikel ve çinko seviyeleri gösterilmiştir. Diyet adı ("analizde "tür") solda gösterilir ve tırnak içindeki değerler hesaplanan seviyedir. Hedef konsantrasyon tırnak işaretleri içinde gösterilir. Çalışmada kullanılan diyetlerin bir alt kümesi, hesaplanan değerlerin gerçekleşen değerlerle hedefte olmasını sağlamak için analiz edilmiştir; Diyet bileşenlerinin bileşiminde genellikle küçük bir değişiklik derecesi olduğu ve bildirilen her satırın sadece bir kopyayı temsil ettiği belirtilmelidir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Banatal</td>
			<td>Pearson X32</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>Bakır (N = 118)</td>
			<td>17.82</td>
			<td>0.0005</td>
		</tr><tr><td>Nikel (N = 152)</td>
			<td>3.45</td>
			<td>0.33</td>
		</tr><tr><td>Çinko (N = 152)</td>
			<td>12.52</td>
			<td>0.006</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 3: Metal konsantrasyonunun sağkalım üzerine etkileri. Her metal için bir ki-kare testinin sonuçları, bir kontrol diyetine göre üç metal konsantrasyonunu zıtlaştırarak gösterilmiştir.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Metal</td>
			<td>F</td>
			<td>P</td>
		</tr><tr><td>Bakır (N = 61)</td>
			<td>F3,57 = 9,84</td>
			<td><0.0001</td>
		</tr><tr><td>Nikel (N = 75)</td>
			<td>F3,71 = 2,35</td>
			<td>0.079</td>
		</tr><tr><td>Çinko (N = 64)</td>
			<td>F3,60= 3,79</td>
			<td>0.015</td>
		</tr></tbody></table>Tablo 4: Metal konsantrasyonunun gelişme süresi üzerindeki etkileri. Gösterilenler, her metal için ayrı ayrı ANOVA'ların sonuçlarıdır.
Veri Kullanılabilirliği:
Tüm veriler Mendeley61'de mevcuttur.

Watch this Scientific Journal Video about Investigating the Tolerance of Cabbage Butterflies to Urban Pollutants at JoVE.com

Bu makale, lahana beyaz kelebeğinin kontrollü laboratuvar koşullarında, erken yaşam beslenmesinin ve toksine maruz kalmanın hassas manipülasyonlarına izin veren yapay bir diyetle yetiştirilmesi için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Temsili sonuçlar, ağır metal toksisitesinin bu protokolle nasıl test edilebileceğini göstermektedir.

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ...

Bu çalışmada, organizmaların şehirler, yol kenarları ve ekin tarlaları gibi antropojenik ortamlarla nasıl başa çıktıklarını anlamakla ilgileniyoruz. Lahana beyaz kelebeklerini bir sistem olarak kullanıyoruz çünkü deneysel olarak manipüle edilmeleri kolaydır. Örneğin, kentsel kirleticilere karşı genetik çeşitlilik hoşgörüsüzlüğünü inceliyoruz.Türler veya alan üzerindeki varyasyonları incelemek için farklı yerlerden ve popülasyonlardan örnekler topluyoruz. Ağlar, soğutucular ve zarflar sahadaki ana araçlarımızdır. Kelebek özellikleri mikroskopi ile ölçülür ve ICP-MS küçük numunelerde ağır metal konsantrasyonlarını ölçmek için en iyi yöntemdir.Mevcut deneysel zorluklardan biri, türler arasındaki çeşitliliği ve insan ortamlarına gelişimsel ayarlamalarını incelemektir. Asıl zorluk, kontrollü deneysel koşullar altında çeşitli türlerin yetiştirilmesinde yatmaktadır. Lahana beyaz kelebeklerinin yetiştirilmesi kolay olsa da, çeşitli bitkilerle beslenen 10 veya 20 farklı tür için uygun benzer diyetler bulmak, deneysel açıdan önemli bir zorluk teşkil etmektedir.Kentsel toksinlere maruz kalmayı azaltmakla ilgileniyoruz, ağır metallerin ve mikroplastikler gibi diğer kentsel kirleticilerin toksisitesini azaltabilecek ekolojik müdahaleler araştırılıyor. Ek olarak, insanlar da dahil olmak üzere orada yaşayan bitki ve hayvanların sağlığını teşvik etmek için şehir alanlarında habitat ceplerinin nasıl tasarlanacağını araştırmayı amaçlıyoruz.

rearing-cabbage-white-butterfly-pieris-rapae-controlled-conditions

Research

JoVE Journal

Biology

Rearing the Cabbage White Butterfly (Pieris rapae) in Controlled Conditions: A Case Study with Heavy Metal Tolerance

1.9K Görüntüleme.  University of Minnesota. Bu çalışmada, organizmaların şehirler, yol kenarları ve ekin tarlaları gibi antropojenik ortamlarla nasıl başa çıktıklarını anlamakla ilgileniyoruz. Lahana beyaz kelebeklerini bir sistem olarak kullanıyoruz çünkü deneysel olarak manipüle edilmeleri kolaydır. Örneğin, kentsel kirleticilere karşı genetik çeşitlilik hoşgörüsüzlüğünü inceliyoruz.Türler veya alan üzerindeki varyasyonları incelemek için farklı yerlerden ve popülasyonlardan örnekler to...

Video: Yazar Gündemi: Lahana Kelebeklerinin Kentsel Kirleticilere Toleransının Araştırılması 

The cabbage white butterfly (Pieris rapae) is an important system for applied pest control research and basic research in behavioral and nutritional ecology. Cabbage whites can be easily reared in controlled conditions on an artificial diet, making them a model organism of the butterfly world. In this paper, a manipulation of heavy metal exposure is used to illustrate basic methods for rearing this species. The general protocol illustrates how butterflies can be caught in the field, induced to lay eggs in greenhouse cages, and transferred as larvae to artificial diets. The methods show how butterflies can be marked, measured, and studied for a variety of research questions. The representative results give an idea of how artificial diets that vary in components can be used to assess butterfly performance relative to a control diet. More specifically, butterflies were most tolerant to nickel and least tolerant to copper, with a tolerance of zinc somewhere in the middle. Possible explanations for these results are discussed, including nickel hyper-accumulation in some mustard host plants and recent evidence in insects that copper may be more toxic than previously appreciated. Finally, the discussion first reviews variations to the protocol and directions for troubleshooting these methods, before considering how future research might further optimize the artificial diet used in this study. Overall, by providing a detailed video overview of the rearing and measurement of cabbage whites on artificial diets, this protocol provides a resource for using this system across a wide range of studies.

This paper presents a detailed protocol for rearing the cabbage white butterfly in controlled lab conditions with an artificial diet, which allows precise manipulations of early-life nutrition and toxin exposure. The representative results show how heavy metal toxicity can be assayed with this protocol.

Biyoloji

Collection and Rearing of Adult Female Butterflies in Controlled Conditions for Egg Harvesting

To begin, collect adult female butterflies with an aerial insect net and place them in the cage to harvest eggs. Place the host plants in pots or in containers with water to maintain the leaf pressure. In case of direct egg collection and transfer to diet, attach a host plant leaf to the top of a plastic cup of water using a rubber band.Then, stretch a piece of Parafilm around the cup's edge, so that females touching the leaf will oviposit onto the Parafilm. Spray the cage with water to maintain the relative humidity high in the cage. If potted plants are watered in the cage, place a towel under the pot to prevent water pooling and to protect butterflies from becoming trapped.Prepare 10%honey water for butterfly feeding. Then, to set up the feeder, rinse the yellow or orange sponges thoroughly with tap water and cut them into small squares. Place the sponges in 60 millimeter plastic Petri dishes and add honey water to them.Change the feeders daily and clean the sponges in a mild bleach solution, followed by thorough rinsing with tap water to prevent mold growth.

Yetişkin dişi kelebeklerin yumurta hasadı için kontrollü koşullarda toplanması ve yetiştirilmesi

Transfer and Rearing of Butterfly Eggs on Agar-Based Diet Until Adult Emergence

Print out a recipe containing weighing ingredients for artificial diet preparation. Weigh all the dry ingredients, except agar, into one container. Place the dry ingredients mixture into a blender and add five milliliters of flaxseed oil to the ingredient mixture.Mix 15 grams of fine mesh agar for each diet batch with 400 milliliters of distilled water in a one-liter beaker. Heat the mixture in a microwave until the agar is close to boiling, with fine bubbles throughout the mixture. After boiling, add 400 milliliters of faucet-temperature distilled water to bring the temperature down to mix with the dry ingredients.Next, place 74-ounce diet cups on the counter with the edges touching. Add the agar mixture to the blender and thoroughly mix. After mixing, pour the mixtures into diet cups, ensuring the diet covers the bottom of each cup.After the diet cools, place lids on the cups. Label the cups with diet type and stack them on trays. House host plant leaves with butterfly eggs in 30-ounce deli cups with a mesh cover inside a 24-degrees Celsius climate chamber.After one week, inspect the cups for late first or early second instar larvae. Using a paintbrush, transfer the larvae to the artificial diet. Place three larvae into each four-ounce cup.Place the cups on their sides in a plastic bin, allowing frass to fall to the bottom and away from the diet, reducing mold and disease risk. House the diet cups in controlled temperature conditions with low to moderate light levels. Monitor the cups for mold or disease every one to two days by inspecting through the clear cup lids.Allow the larvae to pupate and emerge in the diet cups. Carefully remove adult butterflies from the cups with clean hands, gripping all four wings close to their body for a stable hold. To mark the butterflies, hold the dry individuals by the head and thorax.Then, using a fine-tip sharpie, mark a number on the hind wing. Determine the sex of the butterflies by combining wing markings and genitalia examination. Next, grasp the adult by its head and thorax using one hand while opening a wax glassine envelope with the other hand.Then, transfer the adult into the envelope and secure the wings through the envelope. Maintain the butterflies at five to six degrees Celsius for up to one week before experimentation. In this case study, the butterfly survival rate was not affected by increasing the concentration of nickel, but there was a significant effect for both copper and zinc.Butterfly developmental rate was impacted by copper and zinc. As copper concentration increased, there was an increase in development time, with a significant deviation from the control starting at 50 ppm. As zinc concentration increased, there was an increase in development time, with a significant deviation from the control starting at 100 ppm.

Kelebek yumurtalarının yetişkin ortaya çıkana kadar agar bazlı diyetle aktarılması ve yetiştirilmesi

Measuring Wing Traits and Estimating Fecundity in Adult Female Butterflies

To measure wing traits on dead butterflies, hold the thorax in one hand and using forceps, remove each wing at its base. Place the wings in a light box and take photographs for measurements. To measure aspects of reproduction, house the adult butterflies in mating cages, allowing one day for male reproductive maturation and one day for mating.To estimate fecundity, either sacrifice females for egg counts through dissection at set time points or collect eggs daily on host plants. To estimate egg loads, remove the abdomen, place it in PBS, and make a cut along the ventral side. Using forceps, separate the innards from the cuticle and pull the ovaries from the gut, trachea, and other abdomen contents.Carefully uncurl the four ovarioles within each ovary, and observe the transition from mature, yolked, and shelled eggs to immature follicles. Then, use a counter to tally the total number of mature eggs. To assess the mating status of a dissected female, open the bursa copulatrix and separate the spermatophores.