Bu çalışma, Ulusal Bilim ve Teknoloji Konseyi (CONACYT) (702361) tarafından verilen bursla desteklenmiştir. Yazarlar Ph.D. Ulusal Politeknik Enstitüsü Ulusal Biyolojik Bilimler Okulu'nun Biyolojik Kimya Bilimleri programı.

Çalışma, resmi Meksika standardı NOM-062-ZOO-1999'a ve laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımına ilişkin kılavuza uygun olarak yürütülmüştür. Çalışma için onay, Meksika Çocuk Hastanesi Araştırma, Etik ve Biyogüvenlik Komitelerinden (HIM/2023/006) ve Meksika Eduardo Liceaga Genel Hastanesi Araştırma ve Biyoetik Komitesinden (DI/21/501/04/62) alınmıştır. Yaşları 6 ila 8 hafta arasında değişen üç C57BL/6 faresi, kurumsal hayvan bakımı ve kullanım yönergelerine uygun olarak havalandırmalı raflarda izole koşullar altında yetiştirildikleri Meksika Çocuk Hastanesi'nden elde edildi.
1. Malzemelerin ve reaktiflerin hazırlanması
<ol><li>Ca 2+ ve Mg2+ içermeyen PBS'nin yanı sıra Hank'in dengeli tuz çözeltisini (HBSS) 37 °C'ye kadar önceden ısıtın.</li>
	<li>HBSS çözeltisini 100 μg / mL Liferaz ve 4 μg / mL DNaz (HBSS-LD) ile destekleyin. Çözeltinin fizyolojik pH'ını 7.4 olduğundan emin olun. NOT: Omurilik başına 1 mL çalışma solüsyonu gerekli olacaktır.</li>
	<li>Yoğunluk gradyanlı santrifüjleme için izotonik %90'lık bir çözelti hazırlayın (ticari olarak temin edilebilir, Malzeme Tablosuna bakın) ve 37 °C'ye ısıtın.</li>
	<li>% 5 ısıyla inaktive edilmiş fetal sığır serumunu (FBS) PBS ile birleştirerek boyama tamponunu hazırlayın ve karışımı buz üzerinde saklayın.</li>
	<li>Dulbecco'nun Modifiye Eagle'ın Orta-yüksek glikozunu (1 g / L) (DMEM) 37 ° C'ye önceden ısıtın.</li>
	<li>DMEM-S'yi hazırlamak için DMEM ortamını %10 FBS, 2 mM L-glutamin, 200 U/mL penisilin, 200 μg/mL streptomisin ve 500 pg/mL amfoterisin B ile destekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız).</li>
</ol>2. Omuriliğin diseksiyonu ve hazırlanması
<ol><li>Fareyi 150 mg / kg'lık bir dozda intraperitoneal aşırı dozda pentobarbital ile ötenazi yapın. Farenin göğsünü ve sırtını %70 etanol kullanarak sterilize edin. NOT: Fare diseksiyonuna devam etmeden önce ötenazinin başarılı olduğunu onaylayın.</li>
	<li>Torakolomber bölgeyi tıraş edin ve ekstremiteleri yapışkan bant kullanarak diseksiyon tahtasına sabitleyin.</li>
	<li>Bir neşter kullanarak, oksipitalden sakral bölgeye dorsal orta hat boyunca dikkatli bir kesi yapın (Şekil 2).</li>
	<li>Stereoskopik cerrahi mikroskop yardımıyla, lomber omurgaya ulaşana ve son kostal kemeri belirleyene kadar katmanlar halinde inceleyin. NOT: 13 kostal kemer torasik omurlarda eklemlidir; diseke edildiklerinde, L1 omuru2'den daha üstün görünür hale gelirler.</li>
	<li>Son servikal vertebrayı ve sakrumu belirleyin, ardından omurgayı ayırmak için bir kesi yapın (Şekil 2).</li>
	<li>Diseksiyon forsepslerini kullanarak, omuriliği çıkarmak için omurların dorsal laminektomisini gerçekleştirin (Şekil 3A-D). NOT: İlk iki servikal omur (atlas ve axis) hariç, tüm hareketli omurlar çeşitli bölgelerde (servikal, torasik veya lomber) ortak bir morfolojik tasarımı paylaşır. Her tipik hareketli omurun ön ucunda silindirik bir omur gövdesi bulunur. Vücudun arkasına tutturulmuş, vertebral ark (nöral ark) olarak bilinen, lamina ve dikenli süreçlerden oluşan kemikli bir kemerdir. Bu yapılar arasında vertebral foramenbulunur 15.</li>
	<li>Periferik sinir sistemini oluşturan ve infiltre makrofajlar içerebilen foramina (dorsal ve ventral kökler) yoluyla çıkan sinirleri çıkarın (Şekil 3D). NOT: Yoğunluk gradyan ortamı kirletici astrositleri etkili bir şekilde ortadan kaldırdığı için pia mater veya meninkslerin çıkarılması gereksizdir. Ek olarak, meninkslerin tutulması saflaştırma süresini azaltır ve canlılığı artırır.</li>
</ol>3. Doku sindirimi ve mikroglia izolasyonu
<ol><li>Omuriliği diseksiyon tahtasına yerleştirin ve Vannas makası kullanarak omuriliği 2 mm'lik parçalar halinde kesin ve ortalama 10 parça elde edin.</li>
	<li>Omuriliğin bölümlerini 2 mL düz tabanlı bir mikrotüpe aktarın (Şekil 3E, F).</li>
	<li>1 mL HBSS-LD çalışma solüsyonu ekleyin (adım 1.2). 37 °C'de 25 dakika inkübe edin, her 5 dakikada bir kuvvetlice girdap yapın.</li>
	<li>Her sindirimin içeriğini 40 μm'lik bir süzgeçten geçirin ve ardından sindirimi nötralize etmek için% 2 FBS ile 7 mL HBSS ekleyin.</li>
	<li>Kalan dokuyu 1 mL'lik bir şırınga pistonu kullanarak ezin. Süspansiyonu 50 mL'lik konik bir tüpte 5 x g, 220 °C'de 4 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>Süpernatanı 1 mL'lik bir mikropipet kullanarak atın ve peleti 15 mL'lik bir konik tüpte% 2 FBS ile 2 mL HBSS'de yeniden süspanse edin. 2 mL% 90 izotonik yoğunluk gradyan ortamı ile birleştirin. 160 x g, 18 °C'de 25 dakika santrifüjleyin. NOT: Yavaş hızlanmayı kullanın ve freni kullanmaktan kaçının.</li>
	<li>Arayüzü almak ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarmak için bir transfer pipeti kullanın. Hücreleri 10 mL PBS ile yıkayın ve 220 x g, 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.</li>
	<li>DMEM-S'deki hücreleri yeniden süspanse edin (adım 1.6) ve buz üzerinde saklayın.</li>
</ol>4. Saflığın/canlılığın belirlenmesi
<ol><li>Bir hemositometre odası kullanarak canlı hücreleri ölçmek için,% 0.4 Tripan mavisi lekesi kullanın (bkz. Malzeme Tablosu). NOT: Ortalama olarak, tek bir fare 4-6 milyon hücre sağlar.</li>
	<li>Canlı hücreleri bir akış sitometresi aracılığıyla ölçmek için, ticari olarak temin edilebilen amin-reaktif floresan boya boyası kullanın (bkz.<ol><li>1 milyon hücreyi 5 mL'lik polistiren yuvarlak tabanlı (FACS) bir tüpe aktarın. Floresan boyayı PBS ile 1:1000 oranında seyreltin (canlılık çalışma solüsyonunu oluşturur).</li>
		<li>Numuneleri canlılık çözeltisi ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi PBS ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin (adım 1.4).</li>
		<li>Hücreleri 2.4G2 anti-FcRIII/I ile bloke edin (Malzeme Tablosuna bakınız) buz gibi soğuk boyama tamponunda 4 ° C'de 15 dakika boyunca.</li>
		<li>Floresan etiketli monoklonal antikorlar CD45-PerCP ve CD11b-eFluor 450'yi boyama tamponuna (1:300 seyreltmede) ekleyerek antikor boyama kokteylini formüle edin (bkz. NOT: Her iki teknik de mevcut olsa da, sonraki protokole en uygun olanı seçin.</li>
		<li>Numuneleri antikor boyama kokteyli ile karanlıkta 4 °C'de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri buz gibi soğuk boyama tamponu ile iki kez yıkayın. Hücreleri 400 μL boyama tamponunda yeniden süspanse edin.</li>
		<li>Adım 6'daki geçit stratejisinde belirtildiği gibi bir akış sitometresinde 250.000 olay elde edin (Şekil 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. İmmünofloresan boyama
<ol><li>Ön işlemden geçirilmiş bir lamel 6 oyuklu bir plakanın kuyusuna yerleştirin. NOT: Lamelleri tedavi etmek için, bunları 500 μL L-polilisin (0.01 mg/mL, Malzeme Tablosuna bakınız) çözeltisi içeren bir Petri kabına koyun ve 1 saat inkübe edin. Daha sonra üç kez damıtılmış suyla yıkayın ve kurumasını bekleyin.</li>
	<li>500 μL DMEM-S çözeltisi kullanarak 200.000 hücreyi işlenmiş lamel üzerine tohumlayın. 24 saat inkübe edin.</li>
	<li>Lamelleri çıkarın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca% 3.7 paraformaldehit (PFA) kullanarak hücreleri sabitleyin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Hücreleri% 0.2 Triton X-100 ile PBS'de oda sıcaklığında 15 dakika geçirgenleştirin. Daha sonra, lamelleri soğuk PBS ile üç kez yıkayın. Hücreleri oda sıcaklığında 1 saat boyunca PBS'de% 0.2 BSA ile bloke edin.</li>
	<li>Floresan etiketli monoklonal antikorları (1:300 seyreltmede, Malzeme Tablosuna bakınız) bloke edici çözelti içinde seyreltin ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. Lamelleri buz gibi PBS ile üç kez yıkayın.</li>
	<li>Kızağa DAPI içeren montaj ortamı uygulayın ve ardından bir lamel ile kapatın. NOT: Slaytlar bir floresan veya konfokal mikroskop kullanılarak hemen analiz edilebilir veya -20°C'de 3 aya kadar saklanabilir.</li>
</ol>6. Omurilik mikrogliası için geçit stratejisi
<ol><li>Bir nokta grafiği oluşturun ve canlılık boyamaya ve boş bir floresan kanalına dayalı olarak canlı hücreleri izole etmek için bir kapı oluşturun16. Canlı olmayan hücreleri hariç tutun.</li>
	<li>Enkazı ortadan kaldırmak için ileri ve yan saçılma parametrelerini kullanarak başka bir çizim oluşturun16.</li>
	<li>Ek bir nokta grafiği geliştirin ve mikroglia'yı ayırt etmek için CD11b ve CD45'in ekspresyonunu analiz edin.</li>
</ol>

Fare Omuriliğinden Mikroglia'nın Ekstraksiyonu ve Enzimatik Saflaştırılması

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.

Beyin homeostazındaki önemi nedeniyle mikroglia çalışması için çok sayıda protokol geliştirilmiştir. Bu yöntemlerde, mikroglia tipik olarak embriyonik veya yenidoğan sıçanların ve farelerin serebral hemisferlerindenkaynaklanır 17. Sınırlı sayıda çalışma, yetişkin farelerin omuriliklerinden mikroglia'nın saflaştırılmasını ele almıştır13,14. Bu teknikler, genellikle Percoll veya OptiPrep kullanılarak gradya...

Omurgalıların tanımlayıcı özelliği, notokordun yerini, omurlar arası disklere bölünmüş, omur adı verilen bir dizi parçalı kemik ile değiştirdiği vertebral kolon veya omurgadır. Bu kemik materyalinin art arda gelmesi, omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilikkanalını şekillendirir 1. Rodentia cinsinde, omurga genellikle yedi servikal omur, on üç torasik omur, altı lomber omur ve değişken sayıda kaudal vertebradanoluşur 2,3. Omuriliğin uzunluğu omurganınkine benzer ve terminal filum, omuriliği sakruma bağlayan sinirsel olmayan bir yapıdır. Ek olarak, sinir lifleri intervertebral foramen1'den çıkar.
Memelilerde merkezi sinir sisteminin gelişimi ve düzgün işlevi, kritik olarak sinir sisteminin mikroglia4 adı verilen yerleşik makrofajlarının aktivitesine bağlıdır. Mikroglia başlangıçta beyinde yerleşik fagositler olarak tanımlansa da, son araştırmalar bu hücrelere birçok dinamik fonksiyon atfetmiştir 5,6. Mikroglia'nın boyutu homeostazda 7 ila 10 μm arasında değişir; Vücuttaki en çok yönlü hücreler arasında kabul edilirler ve sürekli değişen çevrelerine morfolojik ve işlevsel olarak uyum sağlayabilirler7. Bu hücreler hem embriyonik hem de yetişkin aşamalarda yüksek heterojenlik sergilerler8,9, yetişkin aşamasında ise uzay-zamansal bağlamlarına göre karmaşık fonksiyonel heterojenlik sergilerler10. Mikroglia'nın heterojenliği ve çoklu işlevleri, omurilik ve beyinde diferansiyel gen ekspresyonu ve davranışına izin verir. Omurilikte CD11b, CD45, CD86 ve CCR9 ekspresyonunun beyne göre daha yüksek olduğu gösterilmiştir 8,9.
Serebral mikroglia izolasyonu için çoklu protokoller mevcuttur11,12; Bununla birlikte, omurilik mikroglia13,14 için sadece birkaçı mevcuttur. Mikroglia'yı omurilikten arındırmak için bir yöntemin optimize edilmesi, mikroglia fizyolojisini keşfetmeye odaklanan çok sayıda çalışmanın geliştirilmesini kolaylaştırır. Bu protokol, fare omuriliğinin basit ve yüksek oranda tekrarlanabilir bir ekstraksiyonunu ve mikroglia'nın saflaştırılmasını tanımlamayı amaçlamaktadır (Şekil 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

Vertebral kolon bir omurgalıyı tanımlar ve omuriliği çevreleyen ve koruyan bir boşluk olan omurilik kanalını şekillendirir. Memeli merkezi sinir sisteminin uygun gelişimi ve işlevi, önemli ölçüde mikroglia olarak bilinen yerleşik makrofajların aktivitesine dayanır. Mikroglia, omurilik ve beyinde farklı gen ekspresyonu ve davranışı sağlayan heterojenlik ve çok işlevlilik gösterir. Çok sayıda çalışma, saflaştırma yöntemlerini kapsamlı bir şekilde detaylandıran serebral mikroglia fonksiyonunu araştırmıştır. Bununla birlikte, farelerde mikroglia'nın omurilikten saflaştırılması kapsamlı bir açıklamadan yoksundur. Buna karşılık, rafine edilmemiş bir ekstraktın aksine, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenazın kullanılması, merkezi sinir sistemi dokularında raporlamadan yoksundur. Bu çalışmada, 8-10 haftalık C57BL/6 farelerinden vertebral kolon ve omurilik eksize edildi. Sonraki sindirim, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz kullandı ve mikroglia saflaştırması, bir yoğunluk gradyanı kullandı. Hücreler, CD11b ve CD45 boyama yoluyla canlılık ve saflığı değerlendiren akış sitometrisi için boyandı. Sonuçlar ortalama %80 canlılık ve ortalama %95 saflık verdi. Sonuç olarak, fare mikrogliasının manipülasyonu, yüksek oranda saflaştırılmış bir kollajenaz ve ardından bir yoğunluk gradyanı ile sindirimi içeriyordu. Bu yaklaşım, önemli miktarda omurilik mikroglia popülasyonunu etkili bir şekilde üretti.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

Yazar Spotlight: Omurilik Heterojenliği ve Saflaştırılması Üzerine Mikroglia Araştırması 

Fare omurilik mikrogliasının hızlı ve verimli bir şekilde zenginleştirilmesi

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

Fare omurilik dokusu kullanılarak, kollajenaz ve termolizin ile yüksek oranda zenginleştirilmiş bir karışım kullanılarak enzimatik sindirim gerçekleştirildi. Elde edilen sindirilmiş doku, sindirilmemiş materyali ortadan kaldırmak için 40 μm'lik bir filtreden geçirildi. Toplanan hücreler, alt kısımda %90 ve üst kısımda %45 olmak üzere bir Percoll yoğunluk gradyanı ile zenginleştirildi. Arayüz içindeki mikroglia ile zenginleştirilmiş hücreler daha sonra CD45 ve CD11b antikorları ile boyandı...

Watch this Scientific Journal Video about Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification at JoVE.com

Mikroglia, morfolojik ve fonksiyonel adaptasyon yeteneğine sahip, vücuttaki en çok yönlü hücrelerden biri olarak kabul edilir. Heterojenlikleri ve çok işlevlilikleri, beyin homeostazının korunmasını sağlarken, aynı zamanda çeşitli nörolojik patolojilerle de bağlantılıdır. Burada, omurilik mikrogliasını saflaştırmak için bir teknik açıklanmaktadır.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Araştırmamız, beyin ve omurilik gibi farklı patolojiler ve bölgelerde hem pro-enflamatuar davranışlar sergileyebilen mikroglia'nın heterojenliğine odaklanmaktadır. Çeşitli senaryolarda omurilik mikroglia davranışının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamayı amaçlıyoruz. Mikroglia'nın heterojenliği, onları sınıflandırmayı zorlaştırmıştır.Bu yıl, sadece bir pro veya anti-enflamatuar durumun ötesine geçen yeni ve geniş bir sınıflandırma önerildi. Şu anda, nörolojik patolojilerin hayvan modellerinden omurilik mikrogliasını izole etmede yüksek saflık ve jel elde etmek önemli bir deney ve zorluktur. Kronik ağrı sırasında omurilik mikrogliasında yeni bir sitokin sinyal yolu tanımladık.Protokolümüz daha kontrollü ve somatik bir sindirime ve ardından bir yoğunluk gradyanına izin verir. Her ikisi de, mikroglia'nın omurilik, beyin veya embriyolardan saflaştırılması için şu anda kullanılan tekniklere kıyasla astrositler tarafından daha az kontaminasyona neden olur.

rapid-and-efficient-enrichment-of-mouse-spinal-cord-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.2K Görüntüleme.  Mexico Children's Hospital. Araştırmamız, beyin ve omurilik gibi farklı patolojiler ve bölgelerde hem pro-enflamatuar davranışlar sergileyebilen mikroglia'nın heterojenliğine odaklanmaktadır. Çeşitli senaryolarda omurilik mikroglia davranışının daha derin bir şekilde anlaşılmasını sağlamayı amaçlıyoruz. Mikroglia'nın heterojenliği, onları sınıflandırmayı zorlaştırmıştır.Bu yıl, sadece bir pro veya anti-enflamatuar durumun ötesine geçen yeni ve geniş bir sınıflandırma ö...