تم دعم هذا العمل بمنح من المنح الدراسية المقدمة من المجلس الوطني للعلوم والتكنولوجيا (CONACYT) (702361). يعترف المؤلفون بالدكتوراه برنامج في العلوم الكيميائية البيولوجية من المدرسة الوطنية للعلوم البيولوجية التابعة للمعهد الوطني للفنون التطبيقية.

أجريت الدراسة وفقا للمعيار المكسيكي الرسمي NOM-062-ZOO-1999 ودليل رعاية واستخدام المختبر. تم الحصول على الموافقة على الدراسة من لجان البحث والأخلاقيات والسلامة البيولوجية في مستشفى المكسيك للأطفال (HIM/2023/006) ولجنة البحوث وأخلاقيات البيولوجيا في المستشفى العام في المكسيك إدواردو ليسياغا (DI/21/501/04/62). تم الحصول على ثلاثة فئران C57BL / 6 تتراوح أعمارهم بين 6 و 8 أسابيع من مستشفى مكسيكو للأطفال ، حيث تم تربيتهم في ظروف معزولة في رفوف جيدة التهوية ، وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية لرعاية واستخدامها.
1. تحضير المواد والكواشف
<ol><li>قبل التسخينCa 2+ و Mg2+ مجانا PBS وكذلك محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS) إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استكمل محلول HBSS ب 100 ميكروغرام / مل من الليبراز و 4 ميكروغرام / مل من DNase (HBSS-LD). تأكد من أن الحل يحافظ على درجة الحموضة الفسيولوجية من 7.4. ملاحظة: 1 مل من محلول العمل لكل الحبل الشوكي ستكون ضرورية.</li>
	<li>قم بإعداد محلول متساوي التوتر بنسبة 90٪ للطرد المركزي المتدرج الكثافة (متاح تجاريا ، انظر جدول المواد) وقم بتسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>قم بإعداد المخزن المؤقت للتلوين عن طريق الجمع بين مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة بنسبة 5٪ (FBS) مع برنامج تلفزيوني ، وتخزين الخليط على الثلج.</li>
	<li>قبل التسخين جلوكوز النسر المعدل من Dulbecco (1 جم / لتر) (DMEM) إلى 37 درجة مئوية.</li>
	<li>استكمل وسط DMEM ب 10٪ FBS ، 2 mM L-glutamine ، 200 U / mL البنسلين ، 200 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين ، و 500 بيكوغرام / مل من الأمفوتريسين B (انظر جدول المواد) لتحضير DMEM-S.</li>
</ol>2. تشريح وإعداد الحبل الشوكي
<ol><li>القتل الرحيم للفأر بجرعة زائدة داخل الصفاق من بنتوباربيتال بجرعة 150 مجم / كجم. تعقيم الصدر والظهر الماوس باستخدام 70 ٪ من الإيثانول. ملاحظة: تأكد من نجاح القتل الرحيم قبل متابعة تشريح الفأر.</li>
	<li>حلق منطقة الصدر القطني وثبت الأطراف على لوحة التشريح باستخدام شريط لاصق.</li>
	<li>باستخدام مشرط ، قم بعمل شق دقيق على طول خط الوسط الظهري من القذالي إلى المنطقة المقدسة (الشكل 2).</li>
	<li>بمساعدة المجهر الجراحي المجسم ، تشريح في طبقات حتى تصل إلى العمود الفقري القطني وتحديد القوس الساحلي الأخير. ملاحظة: الأقواس الساحلية ال 13 مفصلية في الفقرات الصدرية. عند تشريحها ، تصبح مرئية متفوقة على الفقرة L12.</li>
	<li>حدد آخر فقرة عنق الرحم والعجز ، ثم قم بعمل قطع لفصل العمود الفقري (الشكل 2).</li>
	<li>باستخدام ملقط التشريح ، قم بإجراء استئصال الصفيحة الفقرية الظهرية للفقرات لاستخراج الحبل الشوكي (الشكل 3A-D). ملاحظة: باستثناء أول فقرتين من عنق الرحم (الأطلس والمحور) ، تشترك جميع الفقرات المتحركة في تصميم مورفولوجي مشترك في مناطق مختلفة (عنق الرحم أو الصدر أو أسفل الظهر). تتميز كل فقرة متحركة نموذجية بجسم فقري أسطواني في نهايتها الأمامية. يرتبط بالجزء الخلفي من الجسم قوس عظمي يعرف باسم القوس الفقري (القوس العصبي) ، ويتكون من الصفيحات والعمليات الشائكة. بين هذه الهياكل تكمن الثقبة الفقرية15.</li>
	<li>إزالة الأعصاب الناشئة من خلال الثقبة (الجذور الظهرية والبطنية) التي تشكل الجهاز العصبي المحيطي وقد تحتوي على بلاعم متسللة (الشكل 3D). ملاحظة: ليس من الضروري إزالة الأم الحنون أو السحايا لأن وسط تدرج الكثافة يزيل الخلايا النجمية الملوثة بشكل فعال. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الاحتفاظ بالسحايا يقلل من وقت التنقية ويعزز قابلية البقاء.</li>
</ol>3. هضم الأنسجة وعزل الخلايا الدبقية الصغيرة
<ol><li>ضع الحبل الشوكي على لوح التشريح ، وباستخدام مقص Vannas ، قم بتقطيع الحبل الشوكي إلى قطع 2 مم ، مما ينتج عنه 10 قطع في المتوسط.</li>
	<li>انقل أقسام الحبل الشوكي إلى أنبوب دقيق مسطح القاع سعة 2 مل (الشكل 3E ، F).</li>
	<li>أضف 1 مل من حل العمل HBSS-LD (الخطوة 1.2). احتضان في 37 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة ، دوامة بقوة كل 5 دقائق.</li>
	<li>مرر محتويات كل عملية هضم من خلال مصفاة 40 ميكرومتر ، ثم أضف 7 مل من HBSS مع 2٪ FBS لتحييد الهضم.</li>
	<li>سحق الأنسجة المتبقية باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل. جهاز طرد مركزي التعليق في أنبوب مخروطي سعة 50 مل لمدة 5 دقائق عند 220 × جم ، 4 درجات مئوية.</li>
	<li>تخلص من المادة الطافية باستخدام ماصة صغيرة سعة 1 مل ، وأعد تعليق الحبيبات في 2 مل من HBSS مع 2٪ FBS في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. يمزج مع 2 مل من 90٪ متوسط تدرج الكثافة متساوي التوتر. جهاز طرد مركزي لمدة 25 دقيقة عند 160 × جم ، 18 درجة مئوية. ملاحظة: استخدم التسارع البطيء وتجنب استخدام الفرامل.</li>
	<li>استخدم ماصة نقل لاسترداد الواجهة ونقلها إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS وأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 220 × جم ، 4 درجات مئوية.</li>
	<li>أعد تعليق الخلايا في DMEM-S (الخطوة 1.6) واحتفظ بها مخزنة على الجليد.</li>
</ol>4. تحديد النقاء / الجدوى
<ol><li>لتحديد كمية الخلايا القابلة للحياة باستخدام غرفة مقياس الدم ، استخدم صبغة تريبان الزرقاء بنسبة 0.4٪ (انظر جدول المواد). ملاحظة: في المتوسط ، يوفر الماوس الواحد 4-6 ملايين خلية.</li>
	<li>لتحديد كمية الخلايا القابلة للحياة عبر مقياس التدفق الخلوي ، استخدم تلطيخ صبغة الفلورسنت التفاعلية للأمين المتاحة تجاريا (انظر جدول المواد).<ol><li>انقل 1 مليون خلية إلى أنبوب بوليسترين مستدير القاع (FACS) سعة 5 مل. تمييع صبغة الفلورسنت مع PBS بنسبة 1: 1000 (إنشاء حل العمل الجدوى).</li>
		<li>احتضان العينات بمحلول الصلاحية في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا باستخدام برنامج تلفزيوني بارد مرتين. أعد تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتلطيخ (الخطوة 1.4).</li>
		<li>قم بسد الخلايا باستخدام 2.4G2 anti-FcRIII / I (انظر جدول المواد) في المخزن المؤقت للتلطيخ المثلج لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.</li>
		<li>قم بصياغة كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة عن طريق إضافة الأجسام المضادة أحادية النسيلة ذات العلامات الفلورية CD45-PerCP و CD11b-eFluor 450 إلى مخزن التلوين المؤقت (بتخفيف 1: 300) (انظر جدول المواد). ملاحظة: أثناء توفر كلتا الطريقتين ، اختر التقنية التي تتوافق بشكل أفضل مع البروتوكول التالي.</li>
		<li>احتضان العينات مع كوكتيل تلطيخ الأجسام المضادة في الظلام عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة. اغسل الخلايا بمحلول تلطيخ بارد مرتين. إعادة تعليق الخلايا في 400 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.</li>
		<li>احصل على 250000 حدث على مقياس التدفق الخلوي ، كما هو موضح في استراتيجية البوابة في الخطوة 6 (الشكل 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. تلطيخ المناعي
<ol><li>ضع غطاء معالج مسبقا في بئر من 6 آبار. ملاحظة: لمعالجة أغطية الغطاء ، ضعها في طبق بتري مع 500 ميكرولتر من محلول L-polylysine (0.01 مجم / مل ، انظر جدول المواد) واحتضانها لمدة 1 ساعة. بعد ذلك ، اغسلها ثلاث مرات بالماء المقطر واتركها حتى تجف.</li>
	<li>زرع 200000 خلية على غطاء الغطاء المعالج باستخدام 500 ميكرولتر من محلول DMEM-S. احتضان لمدة 24 ساعة.</li>
	<li>قم بإزالة أغطية الغطاء وإصلاح الخلايا باستخدام 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد.</li>
	<li>تتخلل الخلايا بنسبة 0.2٪ Triton X-100 في PBS لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، اغسل أغطية الأغطية ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد. سد الخلايا مع 0.2٪ BSA في PBS لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.</li>
	<li>قم بتخفيف الأجسام المضادة أحادية النسيلة ذات العلامات الفلورية (عند تخفيف 1: 300 ، انظر جدول المواد) في محلول الحجب واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. اغسل أغطية الغطاء ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني بارد.</li>
	<li>ضع وسيط التثبيت الذي يحتوي على DAPI على الشريحة ، ثم أغلقه بغطاء غطاء. ملاحظة: يمكن تحليل الشرائح على الفور باستخدام مجهر مضان أو مجهر متحد البؤر ، أو يمكن تخزينها لمدة تصل إلى 3 أشهر عند -20 درجة مئوية.</li>
</ol>6. استراتيجية البوابات للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي
<ol><li>قم بإنشاء مخطط نقطي وإنشاء بوابة لعزل الخلايا القابلة للحياة بناء على تلطيخ الجدوى وقناة الفلورسنت الفارغة16. استبعاد الخلايا غير القابلة للحياة.</li>
	<li>إنتاج قطعة أرض أخرى باستخدام معلمات التشتت الأمامية والجانبية لإزالة الحطام16.</li>
	<li>قم بتطوير مخطط نقطي إضافي وتحليل تعبير CD11b و CD45 للتمييز بين الخلايا الدبقية الصغيرة.</li>
</ol>

استخراج وتنقية الأنزيمية من الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي للفأر

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.

تم تطوير العديد من البروتوكولات لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة بسبب أهميتها في توازن الدماغ. في هذه الطرق ، يتم الحصول على الخلايا الدبقية الصغيرة عادة من نصفي الكرة المخية للجرذان والفئران الجنينية أو حديثي الولادة17. تناول عدد محدود من الدراسات تنقية الخلايا الدبقية الصغي?...

السمة المميزة للفقاريات هي العمود الفقري أو العمود الفقري ، حيث تم استبدال notochord بسلسلة من العظام المجزأة تسمى الفقرات ، مقسومة على أقراص الفقرية. هذا التعاقب من المواد العظمية يشكل القناة الشوكية ، وهو تجويف يحيط ويحمي الحبل الشوكي1. في جنس Rodentia ، يتكون العمود الفقري عادة من سبع فقرات عنق الرحم ، وثلاثة عشر فقرة صدرية ، وست فقرات قطنية ، وعدد متغير من الفقرات الذيلية 2,3. طول الحبل الشوكي مشابه لطول العمود الفقري، والخيط الطرفي هو تركيب غير عصبي يثبت الحبل الشوكي بالعجز. بالإضافة إلى ذلك ، تخرج الألياف العصبية من خلال الثقبة الفقرية1.
يعتمد التطور والوظيفة المناسبة للجهاز العصبي المركزي في الثدييات بشكل حاسم على نشاط الضامة المقيمة في الجهاز العصبي ، والتي تسمى الخلايا الدبقية الصغيرة4. على الرغم من أن الخلايا الدبقية الصغيرة وصفت في البداية بأنها خلايا بلعمية مقيمة في الدماغ ، فقد عزت الأبحاث الحديثة العديد من الوظائف الديناميكية إلى هذه الخلايا 5,6. يتراوح حجم الخلايا الدبقية الصغيرة من 7 إلى 10 ميكرومتر في التوازن. تعتبر من بين الخلايا الأكثر تنوعا في الجسم ويمكن أن تتكيف شكليا ووظيفيا مع بيئتها المتغيرة باستمرار7. تظهر هذه الخلايا عدم تجانس عالي خلال كل من المرحلتين الجنينية والبالغة 8,9 ، بينما في مرحلة البلوغ ، فإنها تظهر أيضا عدم تجانس وظيفي معقد بناء على سياقها الزماني المكاني10. يسمح عدم التجانس والوظائف المتعددة للخلايا الدبقية الصغيرة بالتعبير الجيني التفاضلي والسلوك في الحبل الشوكي والدماغ. لقد ثبت أن تعبير CD11b و CD45 و CD86 و CCR9 أعلى في الحبل الشوكي مقارنة بالدماغ 8,9.
توجد بروتوكولات متعددة لعزل الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية11,12 ؛ ومع ذلك ، لا يوجد سوى عدد قليل من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي13,14. إن تحسين طريقة لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي يسهل تطوير دراسات متعددة تركز على اكتشاف فسيولوجيا الخلايا الدبقية الصغيرة. يهدف هذا البروتوكول إلى وصف استخراج بسيط وقابل للتكرار للغاية للحبل الشوكي للفأر وتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

يحدد العمود الفقري الفقاريات ويشكل القناة الشوكية ، وهي تجويف يحيط بالحبل الشوكي ويحميه. يعتمد التطور السليم ووظيفة الجهاز العصبي المركزي للثدييات بشكل كبير على نشاط الضامة المقيمة المعروفة باسم الخلايا الدبقية الصغيرة. تظهر الخلايا الدبقية الصغيرة عدم التجانس وتعدد الوظائف ، مما يتيح التعبير الجيني المتميز والسلوك داخل الحبل الشوكي والدماغ. استكشفت العديد من الدراسات وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة الدماغية ، مع تفصيل طرق التنقية على نطاق واسع. ومع ذلك ، فإن تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي في الفئران تفتقر إلى وصف شامل. في المقابل ، فإن استخدام كولاجيناز عالي النقاء ، على عكس المستخلص غير المكرر ، يفتقر إلى الإبلاغ داخل أنسجة الجهاز العصبي المركزي. في هذه الدراسة ، تم استئصال العمود الفقري والحبل الشوكي من الفئران C57BL / 6 البالغة من العمر 8-10 أسابيع. استخدم الهضم اللاحق كولاجيناز عالي النقاء ، واستخدمت تنقية الخلايا الدبقية الصغيرة تدرج الكثافة. خضعت الخلايا لتلطيخ لقياس التدفق الخلوي ، وتقييم الجدوى والنقاء من خلال تلطيخ CD11b و CD45. أسفرت النتائج عن متوسط صلاحية 80٪ ومتوسط نقاء 95٪. في الختام ، تضمن التلاعب بالخلايا الدبقية الصغيرة للفأر عملية الهضم باستخدام كولاجيناز عالي النقاء ، يليه تدرج الكثافة. أنتج هذا النهج بشكل فعال أعدادا كبيرة من الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

تسليط الضوء على المؤلف: أبحاث الخلايا الدبقية الصغيرة حول عدم تجانس الحبل الشوكي وتنقيته 

الإثراء السريع والفعال للخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي للفأر

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

باستخدام أنسجة الحبل الشوكي للفأر ، تم إجراء الهضم الأنزيمي باستخدام خليط غني للغاية مع كولاجيناز وثيرموليسين. خضعت الأنسجة المهضومة الناتجة للمرور عبر مرشح 40 ميكرومتر للتخلص من المواد غير المهضومة. تم إثراء الخلايا التي تم جمعها من خلال تدرج كثافة Percoll ، مع 90 ٪ في الجزء السفلي و 45 ٪ في الج...

Watch this Scientific Journal Video about Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification at JoVE.com

تعتبر الخلايا الدبقية الصغيرة من أكثر الخلايا تنوعا في الجسم ، وهي قادرة على التكيف المورفولوجي والوظيفي. يتيح عدم تجانسها وتعدد وظائفها الحفاظ على توازن الدماغ ، بينما ترتبط أيضا بأمراض عصبية مختلفة. هنا ، يتم وصف تقنية لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

يركز بحثنا على عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة ، والتي يمكن أن تظهر سلوكيات مؤيدة ومضادة للالتهابات عبر أمراض ومناطق مختلفة مثل الدماغ والحبل الشوكي. نهدف إلى تمكين فهم أعمق لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي في سيناريوهات متنوعة. عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة جعل من الصعب تصنيفها.هذا العام ، تم اقتراح تصنيف جديد وواسع يتجاوز مجرد حالة مؤيدة أو مضادة للالتهابات. في الوقت الحالي ، يعد تحقيق درجة نقاء عالية وهلام في عزل الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي من النماذج الحيوانية للأمراض العصبية تجربة وتحديا مهما. حددنا مسارا جديدا لإشارات السيتوكين في الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي أثناء الألم المزمن.يسمح بروتوكولنا بهضم أكثر تحكما وجسديا ، يليه تدرج الكثافة. كلاهما يؤدي إلى تلوث أقل بالخلايا النجمية مقارنة بالتقنيات المستخدمة حاليا لتنقية الخلايا الدبقية الصغيرة من الحبل الشوكي أو الدماغ أو الأجنة.

rapid-and-efficient-enrichment-of-mouse-spinal-cord-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.3K Views.  Mexico Children's Hospital. يركز بحثنا على عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغيرة ، والتي يمكن أن تظهر سلوكيات مؤيدة ومضادة للالتهابات عبر أمراض ومناطق مختلفة مثل الدماغ والحبل الشوكي. نهدف إلى تمكين فهم أعمق لسلوك الخلايا الدبقية الصغيرة للحبل الشوكي في سيناريوهات متنوعة. عدم تجانس الخلايا الدبقية الصغ...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: أبحاث الخلايا الدبقية الصغيرة حول عدم تجانس الحبل الشوكي وتنقيته 

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

To begin, with a scalpel, make an incision along the dorsal midline of a euthanized mouse from the occipital to the sacral region. Using a stereoscopic surgical microscope, carefully dissect through layers until the lumbar spine. Identify the last costal arch.Identify the last cervical vertebra and the sacrum. Then make a cut to separate the spine. With a pair of dissecting forceps, perform a dorsal laminectomy of the vertebra to extract the spinal cord.Remove the nerves emerging through the foramina which constitute the peripheral nervous system. Now, place the extracted spinal cord on a dissecting board. With a pair of vannas scissors, cut it into two-millimeter sized pieces.Then transfer the pieces to a two-milliliter flat-bottomed microtube. Add one milliliter of HBSS-LD working solution to the microtube. Incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 25 minutes.Make sure to vigorously vortex the mixture every five minutes. Next, pass the contents of each digestion through a 40-micron-size strainer. Then add seven milliliters of HBSS with 2%FBS to neutralize the digestion and crush the remaining tissue.Transfer the suspension to a 50-milliliter conical tube before centrifuging it at 220 g for five minutes at four degrees Celsius. Now use a one-milliliter micropipette to discard the supernatant. Then resuspend the pellet in two milliliters of HBSS-FBS in a new 15-milliliter conical tube.Add two milliliters of 90%isotonic density gradient medium to the tube, and centrifuge the mixture at 160 g for 25 minutes at 18 degrees Celsius. Finally, with a transfer pipette, retrieve the interphase and transfer it to a 15-milliliter conical tube. Wash the cells with 10 milliliters of PBS, then centrifuge the cells at 220 g for five minutes at five degrees Celsius before further experimentation.The purification of the extracted microglial cells yielded up to 99%cell yield as confirmed by FACS staining. Double positive cells with an average size of 10 micrometers consistent with nonactivated microglia were observed.