Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência e Tecnologia (CONACYT) (702361). Os autores agradecem o programa de Doutoramento em Ciências Químicas Biológicas da Escola Nacional de Ciências Biológicas do Instituto Politécnico Nacional.

O estudo foi conduzido de acordo com a norma oficial mexicana NOM-062-ZOO-1999 e o guia para o cuidado e uso de animais de laboratório. O estudo foi aprovado pelos Comitês de Pesquisa, Ética e Biossegurança do Hospital Infantil do México (HIM/2023/006) e do Comitê de Pesquisa e Bioética do Hospital Geral do México Eduardo Liceaga (DI/21/501/04/62). Três camundongos C57BL/6 com idades entre 6 e 8 semanas foram obtidos do Hospital Infantil do México, onde foram criados em condições isoladas em racks ventilados, de acordo com as diretrizes institucionais de cuidados e uso de animais.
1. Preparação de materiais e reagentes
<ol><li>Pré-aquecer Ca 2+ e Mg2+ PBS livre, bem como solução salina balanceada de Hank (HBSS) a 37 °C.</li>
	<li>Completar a solução de HBSS com 100 μg/mL de Liberase e 4 μg/mL de DNase (HBSS-LD). Certifique-se de que a solução mantém um pH fisiológico de 7,4. NOTA: Será necessário 1 ml de solução de trabalho por medula espinhal.</li>
	<li>Preparar uma solução isotónica a 90% para centrifugação por gradiente de densidade (comercialmente disponível, ver Tabela de Materiais) e pré-aquecer a 37 °C.</li>
	<li>Prepare o tampão de coloração combinando soro fetal bovino (FBS) inativado pelo calor a 5% com PBS e armazene a mistura no gelo.</li>
	<li>Pré-aquecer Dulbecco's Modified Eagle's Medium-high glucose (1g/L) (DMEM) a 37 °C.</li>
	<li>Complementar o meio DMEM com FBS a 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 200 U/mL, estreptomicina 200 μg/mL e 500 pg/mL de anfotericina B (ver Tabela de Materiais) para preparar DMEM-S.</li>
</ol>2. Dissecção e preparo da medula espinhal
<ol><li>Eutanásia do rato com uma sobredosagem intraperitoneal de pentobarbital na dose de 150 mg/kg. Esterilizar o tórax e as costas do rato com etanol a 70%. NOTA: Confirme se a eutanásia foi bem-sucedida antes de prosseguir com a dissecção do rato.</li>
	<li>Raspar a região toracolombar e fixar as extremidades na placa de dissecção com fita adesiva.</li>
	<li>Com o bisturi, realizar incisão cuidadosa ao longo da linha média dorsal, desde a região occipital até a região sacral (Figura 2).</li>
	<li>Com o auxílio de um microscópio cirúrgico estereoscópico, dissecar por planos até atingir a coluna lombar e identificar o último arco costal. OBS: Os 13 arcos costais são articulados nas vértebras torácicas; quando dissecadas, tornam-se visíveis superiores à vértebra L12.</li>
	<li>Determinar a última vértebra cervical e o sacro, em seguida, fazer um corte para separar a coluna vertebral (Figura 2).</li>
	<li>Utilizando pinça dissecante, realizar laminectomia dorsal das vértebras para extração medular (Figura 3A-D). NOTA: Com exceção das duas primeiras vértebras cervicais (atlas e eixo), todas as vértebras móveis compartilham um desenho morfológico comum em várias regiões (cervical, torácica ou lombar). Cada vértebra móvel típica apresenta um corpo vertebral cilíndrico em sua extremidade anterior. Ligado à parte de trás do corpo está um arco ósseo conhecido como arco vertebral (arco neural), consistindo de lâminas e processos espinhosos. Entre essas estruturas encontra-se o forame vertebral15.</li>
	<li>Remover os nervos que emergem através dos forames (raízes dorsais e ventrais) que constituem o sistema nervoso periférico e podem conter macrófagos infiltrados (Figura 3D). NOTA: É desnecessário remover a pia-máter ou meninges, pois o meio de gradiente de densidade efetivamente elimina os astrócitos contaminantes. Além disso, reter as meninges reduz o tempo de purificação e aumenta a viabilidade.</li>
</ol>3. Digestão tecidual e isolamento da microglia
<ol><li>Coloque a medula espinhal na placa dissecante e, usando uma tesoura de Vannas, corte a medula espinhal em pedaços de 2 mm, obtendo-se uma média de 10 pedaços.</li>
	<li>Transfira os cortes da medula espinhal para um microtubo de fundo plano de 2 mL (Figura 3E,F).</li>
	<li>Adicionar 1 ml da solução de trabalho HBSS-LD (passo 1.2). Incubar a 37 °C durante 25 minutos, agitando vigorosamente a cada 5 minutos.</li>
	<li>Passe o conteúdo de cada digestão através de um filtro de 40 μm e, em seguida, adicione 7 mL de HBSS com 2% de FBS para neutralizar a digestão.</li>
	<li>Esmagar o tecido restante com um êmbolo de seringa de 1 mL. Centrifugar a suspensão num tubo cónico de 50 ml durante 5 minutos a 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Eliminar o sobrenadante com uma micropipeta de 1 mL e ressuspender o pellet em 2 mL de HBSS com SFB a 2% em um tubo cônico de 15 mL. Combinar com 2 mL de meio com gradiente de densidade isotônico a 90%. Centrifugar durante 25 min a 160 x g, 18 °C. NOTA: Utilize aceleração lenta e evite usar o freio.</li>
	<li>Use uma pipeta de transferência para recuperar a interface e transferi-la para um tubo cônico de 15 mL. Lavar as células com 10 mL de PBS e centrifugar por 5 min a 220 x g, 4 °C.</li>
	<li>Ressuspenda as células no DMEM-S (etapa 1.6) e mantenha-as armazenadas no gelo.</li>
</ol>4. Determinação da pureza/viabilidade
<ol><li>Para quantificar células viáveis usando uma câmara de hemocitômetro, empregar uma coloração de azul de Tripano a 0,4% (ver Tabela de Materiais). NOTA: Em média, um único rato fornece 4-6 milhões de células.</li>
	<li>Para quantificar células viáveis por meio de um citômetro de fluxo, use a coloração fluorescente reativa à amina disponível comercialmente (ver Tabela de Materiais).<ol><li>Transfira 1 milhão de células para um tubo de fundo redondo de poliestireno (FACS) de 5 mL. Diluir o corante fluorescente com PBS na proporção de 1:1000 (criando a solução de trabalho viável).</li>
		<li>Incubar as amostras com a solução de viabilidade no escuro a 4 °C durante 30 min. Lave as células com PBS gelado duas vezes. Ressuspender as células em 400 μL de tampão corante (passo 1.4).</li>
		<li>Bloquear as células com 2,4G2 anti-FcRIII/I (ver Tabela de Materiais) no tampão de coloração gelada durante 15 minutos a 4 °C.</li>
		<li>Formular o cocktail de coloração de anticorpos adicionando os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência CD45-PerCP e CD11b-eFluor 450 ao tampão de coloração (a uma diluição de 1:300) (ver Tabela de Materiais). Observação : enquanto ambas as técnicas estão disponíveis, escolha a que melhor se alinha com o protocolo subsequente.</li>
		<li>Incubar as amostras com o cocktail de coloração de anticorpos no escuro a 4 °C durante 30 minutos. Lave as células com tampão de coloração gelado duas vezes. Ressuspender as células em 400 μL de tampão corante.</li>
		<li>Adquira 250.000 eventos em um citômetro de fluxo, conforme delineado pela estratégia de gating na etapa 6 (Figura 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Coloração por imunofluorescência
<ol><li>Coloque uma tampa pré-tratada em um poço de uma placa de 6 poços. NOTA: Para tratar as lamínulas, coloque-as numa placa de Petri com 500 μL de solução de L-polilisina (0,01 mg/ml, ver Tabela de Materiais) e incube durante 1 h. Depois, lave-os três vezes com água destilada e deixe-os secar.</li>
	<li>Seme 200.000 células na lamínula tratada usando 500 μL de solução de DMEM-S. Incubar por 24 h.</li>
	<li>Remova as lamínulas e fixe as células com paraformaldeído (PFA) a 3,7% por 20 min à temperatura ambiente. Lave as tampas três vezes com PBS gelado.</li>
	<li>Permeabilizar as células com Triton X-100 a 0,2% em PBS por 15 min à temperatura ambiente. Em seguida, lave as tampas três vezes com PBS frio. Bloquear as células com BSA 0,2% em PBS por 1 h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Diluir os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência (numa diluição de 1:300, ver Tabela de Materiais) na solução de bloqueio e incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Lave as tampas três vezes com PBS gelado.</li>
	<li>Aplique o meio de montagem contendo DAPI sobre a lâmina e, em seguida, sela-a com uma lamínula. NOTA: As lâminas podem ser imediatamente analisadas usando um microscópio de fluorescência ou confocal, ou podem ser armazenadas por até 3 meses a -20°C.</li>
</ol>6. Estratégia de gating para microglia medular
<ol><li>Gere um dot plot e estabeleça uma porta para isolar células viáveis com base na coloração de viabilidade e um canal fluorescente vazio16. Excluir células não viáveis.</li>
	<li>Produza outra parcela utilizando parâmetros de dispersão frontal e lateral para eliminar detritos16.</li>
	<li>Desenvolver um dot plot adicional e analisar a expressão de CD11b e CD45 para diferenciar a micróglia.</li>
</ol>

Extração e Purificação Enzimática da Microglia da Medula Espinhal de Camundongo

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

Os autores declaram não haver conflitos de interesse.

Inúmeros protocolos têm sido desenvolvidos para o estudo da micróglia devido à sua importância na homeostase cerebral. Nesses métodos, as microglias são tipicamente originadas dos hemisférios cerebrais de ratos embrionários ou neonatais e camundongos17. Um número limitado de estudos abordou a purificação da micróglia da medula espinhal de camundongos adultos13,14. Essas técnicas envolvem digestão enzimática usando colagenas...

A característica definidora dos vertebrados é a coluna vertebral ou coluna vertebral, na qual a notocorda foi substituída por uma sequência de ossos segmentados chamados vértebras, divididos por discos intervertebrais. Essa sucessão de material ósseo forma o canal vertebral, uma cavidade que envolve e protege a medula espinhal1. No gênero Rodentia, a coluna vertebral é geralmente formada por sete vértebras cervicais, treze vértebras torácicas, seis vértebras lombares e um número variável de vértebrascaudais2,3. O comprimento da medula espinhal é semelhante ao da coluna vertebral, e o filo terminal é uma estrutura não nervosa que ancora a medula espinhal ao sacro. Além disso, as fibras nervosas saem pelo forame intervertebral1.
O desenvolvimento e o funcionamento adequado do sistema nervoso central em mamíferos dependem criticamente da atividade dos macrófagos residentes no sistema nervoso, chamados de micróglia4. Embora as microglias tenham sido inicialmente descritas como fagócitos residentes no cérebro, pesquisas recentes têm atribuído muitas funções dinâmicas a essascélulas5,6. O tamanho da microglia varia de 7 a 10 μm na homeostase; São consideradas células mais versáteis do organismo e podem adaptar-se morfológica e funcionalmente ao seu ambiente em constantemudança7. Essas células exibem alta heterogeneidade tanto na fase embrionária quanto naadulta8,9, enquanto na fase adulta também apresentam complexa heterogeneidade funcional baseada em seu contexto espaço-temporal10. A heterogeneidade e as múltiplas funções da microglia permitem a expressão gênica e o comportamento diferenciais na medula espinhal e no cérebro. Foi demonstrado que a expressão de CD11b, CD45, CD86 e CCR9 é maior na medula espinhal em comparação com o cérebro 8,9.
Existem múltiplos protocolos para o isolamento da microglia cerebral11,12; entretanto, existem poucos para a microglia medular13,14. A otimização de um método para purificar a microglia da medula espinhal facilita o desenvolvimento de múltiplos estudos focados na descoberta da fisiologia da microglia. Este protocolo tem como objetivo descrever uma extração simples e altamente reprodutível da medula espinhal de camundongos e a purificação da micróglia (Figura 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

A coluna vertebral define um vertebrado e molda o canal vertebral, uma cavidade que encerra e protege a medula espinhal. O desenvolvimento e a função adequados do sistema nervoso central de mamíferos dependem significativamente da atividade de macrófagos residentes conhecidos como microglia. A microglia apresenta heterogeneidade e multifuncionalidade, permitindo expressão gênica e comportamento distintos dentro da medula espinhal e do cérebro. Numerosos estudos têm explorado a função da microglia cerebral, detalhando extensivamente os métodos de purificação. No entanto, a purificação da micróglia da medula espinhal em camundongos carece de uma descrição abrangente. Em contraste, a utilização de uma colagenase altamente purificada, em oposição a um extrato não refinado, carece de relatos nos tecidos do sistema nervoso central. Neste estudo, a coluna vertebral e a medula espinhal foram excisadas de camundongos C57BL/6 com 8-10 semanas de idade. A digestão subsequente empregou uma colagenase altamente purificada, e a purificação da micróglia utilizou um gradiente de densidade. As células foram submetidas à coloração por citometria de fluxo, avaliando-se viabilidade e pureza através das colorações CD11b e CD45. Os resultados mostraram viabilidade média de 80% e pureza média de 95%. Em conclusão, a manipulação da micróglia de camundongos envolveu digestão com colagenase altamente purificada, seguida de gradiente de densidade. Essa abordagem efetivamente produziu populações substanciais de microglia medular.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

Autor em destaque: Pesquisa de microglia sobre heterogeneidade e purificação da medula espinhal 

Enriquecimento rápido e eficiente da microglia medular de camundongos

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

Utilizando tecido medular de camundongos, a digestão enzimática foi realizada utilizando uma mistura altamente enriquecida com colagenase e termolisina. O tecido digerido resultante foi submetido à passagem por um filtro de 40 μm para eliminar o material não digerido. As células coletadas foram enriquecidas através de um gradiente de densidade de Percoll, com 90% na porção inferior e 45% na porção superior. As células enriquecidas com microglia dentro da interface foram então coradas com anticorpos CD45 e CD...

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As microglias são consideradas algumas das células mais versáteis do organismo, capazes de adaptação morfológica e funcional. Sua heterogeneidade e multifuncionalidade possibilitam a manutenção da homeostase cerebral, além de estarem ligadas a diversas patologias neurológicas. Aqui, uma técnica para purificar a microglia da medula espinhal é descrita.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

Nossa pesquisa se concentra na heterogeneidade da microglia, que pode exibir comportamentos pró e anti-inflamatórios em diferentes patologias e regiões como o cérebro e a medula espinhal. Nosso objetivo é possibilitar uma compreensão mais profunda do comportamento da microglia medular em diversos cenários. A heterogeneidade das micróglias tem dificultado sua classificação.Este ano, foi proposta uma nova e ampla classificação que vai além de apenas um estado pró ou anti-inflamatório. Atualmente, alcançar alta pureza e gel no isolamento da microglia medular de modelos animais de patologias neurológicas é um experimento e um desafio significativos. Identificamos uma nova via de sinalização de citocinas na microglia da medula espinhal durante a dor crônica.Nosso protocolo permite uma digestão mais controlada e somática, seguida de um gradiente de densidade. Ambos resultam em menos contaminação por astrócitos em comparação com as técnicas atualmente empregadas para a purificação da microglia da medula espinhal, cérebro ou embriões.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.3K visualizações.  Mexico Children's Hospital. Nossa pesquisa se concentra na heterogeneidade da microglia, que pode exibir comportamentos pró e anti-inflamatórios em diferentes patologias e regiões como o cérebro e a medula espinhal. Nosso objetivo é possibilitar uma compreensão mais profunda do comportamento da microglia medular em diversos cenários. A heterogeneidade das micróglias tem dificultado sua classificação.Este ano, foi proposta uma nova e ampla classificação que vai além de apenas um estado pró ou anti-in...

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The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

Neurociência

Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

To begin, with a scalpel, make an incision along the dorsal midline of a euthanized mouse from the occipital to the sacral region. Using a stereoscopic surgical microscope, carefully dissect through layers until the lumbar spine. Identify the last costal arch.Identify the last cervical vertebra and the sacrum. Then make a cut to separate the spine. With a pair of dissecting forceps, perform a dorsal laminectomy of the vertebra to extract the spinal cord.Remove the nerves emerging through the foramina which constitute the peripheral nervous system. Now, place the extracted spinal cord on a dissecting board. With a pair of vannas scissors, cut it into two-millimeter sized pieces.Then transfer the pieces to a two-milliliter flat-bottomed microtube. Add one milliliter of HBSS-LD working solution to the microtube. Incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 25 minutes.Make sure to vigorously vortex the mixture every five minutes. Next, pass the contents of each digestion through a 40-micron-size strainer. Then add seven milliliters of HBSS with 2%FBS to neutralize the digestion and crush the remaining tissue.Transfer the suspension to a 50-milliliter conical tube before centrifuging it at 220 g for five minutes at four degrees Celsius. Now use a one-milliliter micropipette to discard the supernatant. Then resuspend the pellet in two milliliters of HBSS-FBS in a new 15-milliliter conical tube.Add two milliliters of 90%isotonic density gradient medium to the tube, and centrifuge the mixture at 160 g for 25 minutes at 18 degrees Celsius. Finally, with a transfer pipette, retrieve the interphase and transfer it to a 15-milliliter conical tube. Wash the cells with 10 milliliters of PBS, then centrifuge the cells at 220 g for five minutes at five degrees Celsius before further experimentation.The purification of the extracted microglial cells yielded up to 99%cell yield as confirmed by FACS staining. Double positive cells with an average size of 10 micrometers consistent with nonactivated microglia were observed.