עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמלגה שהוענקה על ידי המועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה (CONACYT) (702361). המחברים מודים לתוכנית הדוקטורט במדעי הכימיה הביולוגית של בית הספר הלאומי למדעים ביולוגיים של המכון הפוליטכני הלאומי.

המחקר נערך בהתאם לתקן המקסיקני הרשמי NOM-062-ZOO-1999 והמדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. האישור למחקר התקבל מוועדות המחקר, האתיקה והבטיחות הביולוגית של בית החולים לילדים במקסיקו (HIM/2023/006) ומועדת המחקר והביואתיקה של בית החולים הכללי של מקסיקו אדוארדו ליסאגה (DI/21/501/04/62). שלושה עכברי C57BL/6 בגילאי 6 עד 8 שבועות התקבלו מבית החולים לילדים במקסיקו, שם גודלו בתנאים מבודדים במדפים מונשמים, בהתאם להנחיות המוסדיות לטיפול ושימוש בבעלי חיים.
1. הכנת חומרים וריאגנטים
<ol><li>PBS ללא Ca2 + ו-Mg2+ טרום חם, כמו גם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) ל-37°C.</li>
	<li>השלימו את תמיסת HBSS עם 100 מיקרוגרם/מ"ל של Liberase ו-4 מיקרוגרם/מ"ל של DNase (HBSS-LD). ודא כי הפתרון שומר על pH פיזיולוגי של 7.4. הערה: 1 מ"ל של פתרון עבודה לכל חוט השדרה יהיה צורך.</li>
	<li>הכינו תמיסה איזוטונית של 90% לצנטריפוגה הדרגתית בצפיפות (זמינה מסחרית, ראו טבלת חומרים) וחממו אותה מראש ל-37°C.</li>
	<li>הכינו את חיץ הצביעה על ידי שילוב של סרום בקר עוברי 5% מומת חום (FBS) עם PBS, ואחסנו את התערובת על קרח.</li>
	<li>חימום מראש של גלוקוז בינוני-גבוה של Dulbecco של Dulbecco (1g / L) (DMEM) עד 37 ° C.</li>
	<li>השלם את מדיום DMEM עם 10% FBS, 2 mM L-גלוטמין, 200 U / מ"ל פניצילין, 200 מיקרוגרם / מ"ל של סטרפטומיצין, ו 500 pg / מ"ל של אמפוטריצין B (ראה טבלה של חומרים) להכנת DMEM-S.</li>
</ol>2. דיסקציה והכנה של חוט השדרה
<ol><li>המתת חסד העכבר עם מנת יתר intraperitoneal של pentobarbital במינון של 150 מ"ג / ק"ג. לעקר את בית החזה והגב של העכבר באמצעות 70% אתנול. הערה: ודא שהמתת החסד בוצעה בהצלחה לפני שתמשיך בנתיחת העכבר.</li>
	<li>יש לגלח את אזור בית החזה ולהצמיד את הגפיים ללוח הדיסקציה באמצעות סרט הדבקה.</li>
	<li>באמצעות אזמל, בצעו חתך זהיר לאורך קו האמצע הגבי מהעורפית לאזור העצה (איור 2).</li>
	<li>בעזרת מיקרוסקופ כירורגי סטריאוסקופי יש לנתח בשכבות עד להגעה לעמוד השדרה המותני וזיהוי הקשת הקוסטלית האחרונה. הערה: 13 הקשתות הקוסטליות מבוטאות בחוליות בית החזה; כאשר הם מנותחים, הם נראים עליונים על חוליה L12.</li>
	<li>קבעו את החוליה הצווארית האחרונה ואת עצם העצה, ואז בצעו חתך כדי להפריד את עמוד השדרה (איור 2).</li>
	<li>באמצעות שימוש במלקחיים מנתחים, בצעו כריתת למינקטומיה גבית של החוליות כדי לחלץ את חוט השדרה (איור 3A-D). הערה: למעט שתי החוליות הצוואריות הראשונות (אטלס וציר), כל החוליות הנעות חולקות עיצוב מורפולוגי משותף באזורים שונים (צוואר הרחם, בית החזה או מותני). כל חוליה ניידת טיפוסית כוללת גוף חוליה גלילי בקצה הקדמי שלה. לחלק האחורי של הגוף מחוברת קשת גרמית המכונה קשת חולייתית (קשת עצבית), המורכבת מתהליכים למינה ועמוד השדרה. בין מבנים אלה נמצא פתח החוליות15.</li>
	<li>הסירו את העצבים היוצאים דרך הפורמינה (שורשים גביים וגחונים) שמרכיבים את מערכת העצבים ההיקפית ועשויים להכיל מקרופאגים שחדרו (איור 3D). הערה: אין צורך להסיר את pia mater או את קרומי המוח מכיוון שתווך שיפוע הצפיפות מבטל ביעילות אסטרוציטים מזהמים. בנוסף, שמירה על קרומי המוח מפחיתה את זמן הטיהור ומשפרת את הכדאיות.</li>
</ol>3. עיכול רקמות ובידוד של מיקרוגליה
<ol><li>הניחו את חוט השדרה על לוח הניתוח, ובעזרת מספריים של Vannas, חתכו את חוט השדרה לחתיכות של 2 מ"מ, והניבו בממוצע 10 חלקים.</li>
	<li>העבירו את חלקי חוט השדרה למיקרו-צינורית שטוחה בנפח 2 מ"ל (איור 3E,F).</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של פתרון העבודה HBSS-LD (שלב 1.2). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 25 דקות, תוך ערבול נמרץ כל 5 דקות.</li>
	<li>מעבירים את התוכן של כל עיכול דרך מסננת של 40 מיקרומטר, ולאחר מכן מוסיפים 7 מ"ל של HBSS עם 2% FBS כדי לנטרל את העיכול.</li>
	<li>למחוץ את הרקמה הנותרת באמצעות מזרק 1 מ"ל בוכנה. צנטריפוגה את המתלה בצינור חרוטי 50 מ"ל במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.</li>
	<li>השליכו את הסופרנאטנט באמצעות מיקרופיפטה של 1 מ"ל, והשהו מחדש את הגלולה ב-2 מ"ל HBSS עם 2% FBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל. שלב עם 2 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות איזוטונית 90%. צנטריפוגה למשך 25 דקות ב 160 x גרם, 18 ° C. הערה: השתמש בהאצה איטית והימנע משימוש בבלם.</li>
	<li>השתמש פיפטה העברה כדי לאחזר את הממשק ולהעביר אותו לצינור חרוטי 15 מ"ל. לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS וצנטריפוגה במשך 5 דקות ב 220 x גרם, 4 ° C.</li>
	<li>השהה מחדש את התאים ב- DMEM-S (שלב 1.6) ושמור אותם מאוחסנים על קרח.</li>
</ol>4. קביעת טוהר/כדאיות
<ol><li>לכימות תאים בני קיימא באמצעות תא המוציטומטר, השתמש בכתם כחול טריפאן 0.4% (ראה טבלת חומרים). הערה: בממוצע, עכבר יחיד מספק 4-6 מיליון תאים.</li>
	<li>כדי לכמת תאים בני קיימא באמצעות ציטומטר זרימה, השתמש בצביעת צבע פלואורסצנטי תגובתי אמין זמין מסחרית (ראה טבלת חומרים).<ol><li>העבר מיליון תאים לתוך צינור פוליסטירן בעל תחתית עגולה (FACS) של 5 מ"ל. לדלל את הצבע הפלואורסצנטי עם PBS ביחס של 1:1000 (יצירת פתרון עבודה כדאיות).</li>
		<li>לדגור את הדגימות עם פתרון קיימא בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם PBS קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה (שלב 1.4).</li>
		<li>חסום את התאים עם 2.4G2 anti-FcRIII/I (ראה טבלת חומרים) במאגר הצביעה הקר כקרח למשך 15 דקות ב- 4°C.</li>
		<li>ניסוח קוקטייל צביעת הנוגדנים על ידי הוספת נוגדנים חד-שבטיים בעלי תווית פלואורסצנטית CD45-PerCP ו-CD11b-eFluor 450 למאגר הצביעה (בדילול של 1:300) (ראה טבלת חומרים). הערה: כאשר שתי הטכניקות זמינות, בחר את זו המתאימה ביותר לפרוטוקול הבא.</li>
		<li>לדגור את הדגימות עם קוקטייל מכתים נוגדנים בחושך ב 4 ° C במשך 30 דקות. שטפו את התאים עם חיץ כתמים קר כקרח פעמיים. להשהות מחדש את התאים ב 400 μL של חיץ צביעה.</li>
		<li>רכוש 250,000 אירועים על ציטומטר זרימה, כפי שמתואר על ידי אסטרטגיית gating בשלב 6 (איור 4).</li>
	</ol></li>
</ol>5. צביעה אימונופלואורסצנטית
<ol><li>מניחים את הכיסוי המטופל מראש בבאר של צלחת בעלת 6 בארות. הערה: כדי לטפל בכיסויים, הניחו אותם בצלחת פטרי עם תמיסת L-פוליליזין (0.01 מ"ג/מ"ל, ראו טבלת חומרים) ודגרו במשך שעה אחת. לאחר מכן, שטפו אותם שלוש פעמים במים מזוקקים ואפשרו להם להתייבש.</li>
	<li>זרעו 200,000 תאים על הכיסוי המטופל באמצעות 500 μL של תמיסת DMEM-S. דגירה במשך 24 שעות.</li>
	<li>הסירו את הכיסויים וקיבעו את התאים באמצעות 3.7% פרפורמלדהיד (PFA) למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>חדרו לתאים עם 0.2% Triton X-100 ב-PBS למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לשטוף את coverslips שלוש פעמים עם PBS קר. חסום את התאים עם 0.2% BSA ב- PBS למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>יש לדלל את הנוגדנים החד-שבטיים בעלי התווית הפלואורסצנטית (בדילול של 1:300, ראו טבלת חומרים) בתמיסת החסימה ולדגור במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. שטפו את הכיסויים שלוש פעמים עם PBS קר כקרח.</li>
	<li>החל אמצעי הרכבה המכיל DAPI על השקופית ולאחר מכן אטם אותה באמצעות כיסוי. הערה: ניתן לנתח את השקופיות באופן מיידי באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או קונפוקלי, או לאחסן אותן עד 3 חודשים בטמפרטורה של -20°C.</li>
</ol>6. אסטרטגיית Gating עבור מיקרוגליה חוט השדרה
<ol><li>צור תרשים נקודה וקבע שער לבידוד תאים בני קיימא בהתבסס על צביעת כדאיות ותעלה פלואורסצנטית ריקה16. אל תכלול תאים שאינם בני קיימא.</li>
	<li>הפק חלקה נוספת תוך שימוש בפרמטרים של פיזור קדימה וצד כדי לסלק פסולת16.</li>
	<li>לפתח תרשים נקודה נוסף ולנתח את הביטוי של CD11b ו- CD45 כדי להבדיל מיקרוגליה.</li>
</ol>

חילוץ וטיהור אנזימטי של מיקרוגליה מחוט השדרה של העכבר

<ol>
	<li>Schr&#246;der, H., Schr&#246;der, , Moser, , Huggenberger, , et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).</li><li>Sengul, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoarchitecture+of+the+spinal+cord+of+the+postnatal+(P4)+mouse.">Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse.</a> Anat Rec. 295, 837-845 (2012).</li><li>Bab, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).</li><li>Nayak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+development+and+function.">Microglia development and function.</a> Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).</li><li>Martinez, F. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization.">Macrophage activation and polarization.</a> Front Biosci. 13, 453-461 (2008).</li><li>Masuda, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+heterogeneity+in+the+single-cell+era.">Microglia heterogeneity in the single-cell era.</a> Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).</li><li>Prinz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+biology:+one+century+of+evolving+concepts.">Microglia biology: one century of evolving concepts.</a> Cell. 179 (2), 292-311 (2019).</li><li>de Haas, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Region-specific+expression+of+immunoregulatory+proteins+on+microglia+in+the+healthy+CNS.">Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS.</a> Glia. 56 (8), 888-894 (2008).</li><li>Xuan, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differences+of+microglia+in+the+brain+and+the+spinal+cord.">Differences of microglia in the brain and the spinal cord.</a> Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).</li><li>Paolicelli, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+states+and+nomenclature:+A+field+at+its+crossroads.">Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads.</a> Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).</li><li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+IL-36&#947;/IL-36R+participates+in+the+maintenance+of+chronic+inflammatory+pain+through+astroglial+JNK+pathway.">Spinal IL-36&#947;/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway.</a> Glia. 67 (3), 438-451 (2019).</li><li>Prinz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+and+central+nervous+system-associated+macrophages-from+origin+to+disease+modulation.">Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation.</a> Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).</li><li>Yip, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+isolation+and+culture+of+primary+microglia+from+adult+mouse+spinal+cord.">Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord.</a> J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).</li><li>Akhmetzyanova, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Severity-+and+time-dependent+activation+of+microglia+in+spinal+cord+injury.">Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury.</a> Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).</li><li>Mahadevan, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+vertebral+column.">Anatomy of the vertebral column.</a> Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).</li><li>Krukowski, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporary+microglia-depletion+after+cosmic+radiation+modifies+phagocytic+activity+and+prevents+cognitive+deficits.">Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits.</a> Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).</li><li>Cardona, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+murine+microglial+cells+for+RNA+analysis+or+flow+cytometry.">Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry.</a> Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).</li><li>Schmidt, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+enzymatic+efficiency+of+Liberase+TM+and+tumor+dissociation+enzyme:+effect+on+the+viability+of+cells+digested+from+fresh+and+cryopreserved+human+ovarian+cortex.">Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex.</a> Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).</li><li>Kusminski, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MitoNEET-parkin+effects+in+pancreatic+&#945;-+and+&#946;-cells,+cellular+survival,+and+intrainsular+cross+talk.">MitoNEET-parkin effects in pancreatic &#945;- and &#946;-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk.</a> Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).</li></ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

פרוטוקולים רבים פותחו לחקר תאי מיקרוגליה בשל חשיבותם בהומאוסטזיס של המוח. בשיטות אלה, תאי מיקרוגליה מקורם בדרך כלל בהמיספרות מוחיות של חולדות ועכברים עובריים או יילודים17. מספר מצומצם של מחקרים התייחסו לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה של עכברים בוגרים13,14<sup ...

המאפיין המגדיר של בעלי חוליות הוא עמוד השדרה או עמוד השדרה, שבו הנוטוכורד הוחלף ברצף של עצמות מקוטעות הנקראות חוליות, המחולקות על ידי דיסקים בין-חולייתיים. רצף זה של חומר גלוסקמי מעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ומגן על חוט השדרה1. בסוג Rodentia, עמוד השדרה נוצר בדרך כלל על ידי שבע חוליות צוואריות, שלוש עשרה חוליות בית החזה, שש חוליות מותניות ומספר משתנה של חוליות קאודליות 2,3. אורך חוט השדרה דומה לזה של עמוד השדרה, והפילום הטרמינלי הוא מבנה לא עצבי המעגן את חוט השדרה לעצה. בנוסף, סיבי עצב יוצאים דרך הפתח הבין חולייתי1.
התפתחותה ותפקודה התקין של מערכת העצבים המרכזית ביונקים תלויים באופן קריטי בפעילות המקרופאגים השוכנים במערכת העצבים, הנקראים מיקרוגליה4. למרות שתאי מיקרוגליה תוארו בתחילה כפגוציטים שוכני מוח, מחקר שנערך לאחרונה ייחס תפקודים דינמיים רבים לתאים אלה 5,6. גודלה של מיקרוגליה נע בין 7 ל -10 מיקרומטר בהומאוסטזיס; הם נחשבים בין התאים הרבגוניים ביותר בגוף ויכולים להסתגל מורפולוגית ותפקודית לסביבתם המשתנה ללא הרף7. תאים אלה מפגינים הטרוגניות גבוהה הן בשלב העוברי והן בשלב הבוגר 8,9, ואילו בשלב הבוגר הם מפגינים גם הטרוגניות תפקודית מורכבת בהתבסס על ההקשר המרחבי-זמני שלהם10. ההטרוגניות והתפקודים המרובים של תאי מיקרוגליה מאפשרים ביטוי גנים דיפרנציאליים והתנהגות בחוט השדרה ובמוח. הוכח כי ביטוי CD11b, CD45, CD86 ו- CCR9 גבוה יותר בחוט השדרה בהשוואה למוח 8,9.
קיימים פרוטוקולים מרובים לבידוד תאי מיקרוגליה במוח11,12; עם זאת, רק מעטים קיימים עבור מיקרוגליה חוט השדרה13,14. אופטימיזציה של שיטה לטיהור מיקרוגליה מחוט השדרה מאפשרת פיתוח של מחקרים מרובים המתמקדים בגילוי הפיזיולוגיה של מיקרוגליה. פרוטוקול זה נועד לתאר מיצוי פשוט וקל מאוד לשחזור של חוט השדרה של העכבר וטיהור תאי מיקרוגליה (איור 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>15 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430790</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL microtubes</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>MCT-200-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4G2 anti-FcR</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL collection tubes</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>430829</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b)</td>
			<td>Gibco, USA</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse</td>
			<td>eBioscience, USA</td>
			<td>48-0112</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibody CD45 PerCP anti-mouse&#160;&#160;</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>103130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>46-013-CM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue Cell Strainer 40 &#956;m</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Costar 6-well Clear Not Treated&#160;</td>
			<td>Corning, USA</td>
			<td>CLS3736</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Heating Shaking Drybath&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA</td>
			<td>88870001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting forceps for microsurgery</td>
			<td>FT by DUMONT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>4536282001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#180;s Modified Eagle&#180;s Medium-high glucose (DMEM)&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>D6429</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric shaver</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>Thermo, USA</td>
			<td>352058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>PAN Biotech, Alemania</td>
			<td>P30-3306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer Cytoflex&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s balanced salt solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>H2387</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-glutamine</td>
			<td>Corning, USA&#160;</td>
			<td>15393631</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liberase TM&#160;</td>
			<td>Roche, USA</td>
			<td>5401119001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber Counting Chambers</td>
			<td>China</td>
			<td>1103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pentobarbital</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Percoll&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>17089101</td>
			<td>density gradient centrifugation&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-L-lysine solution&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel No. 25&#160;</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td>H23</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL</td>
			<td>Axygen, USA</td>
			<td>10011-680</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereoscopic microscope</td>
			<td>Velab, Mexico</td>
			<td>HG927831</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight surgical scissors (10 cm)</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight Vannas scissors</td>
			<td>HERGOM, Mexico</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X100</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue Stain 0.4%&#160;</td>
			<td>Merck, USA</td>
			<td>15250-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex mixer</td>
			<td>DLAB, China</td>
			<td>8031102000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zombie Aqua Fixable Viability Kit</td>
			<td>BioLegend, USA</td>
			<td>423102</td>
			<td>amine-reactive fluorescent dye staining&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

rapid and efficient enrichment of mouse spinal cord microglia

עמוד השדרה מגדיר חוליה ומעצב את תעלת עמוד השדרה, חלל התוחם ושומר על חוט השדרה. התפתחות ותפקוד תקין של מערכת העצבים המרכזית של יונקים מסתמכים באופן משמעותי על פעילותם של מקרופאגים מקומיים המכונים מיקרוגליה. מיקרוגליה מציגה הטרוגניות ורב-תפקודיות, ומאפשרת ביטוי גנים והתנהגות מובחנים בתוך חוט השדרה והמוח. מחקרים רבים בחנו את תפקוד תאי המיקרוגליה במוח, ומפרטים בהרחבה את שיטות הטיהור. עם זאת, טיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה בעכברים חסר תיאור מקיף. לעומת זאת, השימוש בקולגנאז מטוהר מאוד, בניגוד לתמצית לא מזוקקת, חסר דיווח ברקמות מערכת העצבים המרכזית. במחקר זה, עמוד השדרה וחוט השדרה נכרתו מעכברי C57BL/6 בני 8-10 שבועות. העיכול שלאחר מכן השתמש בקולגנאז מטוהר מאוד, וטיהור מיקרוגליה השתמש בשיפוע צפיפות. התאים עברו צביעה לצורך ציטומטריית זרימה, הערכת כדאיות וטוהר באמצעות צביעת CD11b ו-CD45. התוצאות הניבו כדאיות ממוצעת של 80% וטוהר ממוצע של 95%. לסיכום, מניפולציה של מיקרוגליה בעכבר כללה עיכול עם קולגן מטוהר מאוד, ואחריו שיפוע צפיפות. גישה זו יצרה למעשה אוכלוסיות משמעותיות של מיקרוגליה בחוט השדרה.

The defining characteristic of vertebrates is the vertebral column or spine, in which the notochord has been replaced by a sequence of segmented bones called vertebrae, divided by intervertebral discs. This succession of osseous material shapes the spinal canal, a cavity that encloses and protects the spinal cord1. In the genus Rodentia, the spine is usually formed by seven cervical vertebrae, thirteen thoracic vertebrae, six lumbar vertebrae, and a variable number of caudal vertebrae2,3. The length of the spinal cord is similar to that of the spine, and the terminal filum is a non-nervous structure that anchors the spinal cord to the sacrum. Additionally, nerve fibers exit through the intervertebral foramen1.
The development and proper function of the central nervous system in mammals critically depend on the activity of the nervous system&#39;s resident macrophages, called microglia4. Although microglia were initially described as brain resident phagocytes, recent research has attributed many dynamic functions to these cells5,6. Microglia&#39;s size ranges from 7 to 10 &#181;m in homeostasis; they are considered among the most versatile cells in the body and can adapt morphologically and functionally to their constantly changing environment7. These cells exhibit high heterogeneity during both the embryonic and adult stages8,9, while in the adult stage, they also display complex functional heterogeneity based on their spatiotemporal context10. The heterogeneity and multiple functions of microglia allow for differential gene expression and behavior in the spinal cord and brain. It has been shown that CD11b, CD45, CD86, and CCR9 expression is higher in the spinal cord compared to the brain8,9.
Multiple protocols exist for cerebral microglia isolation11,12; however, only a few exist for spinal cord microglia13,14. Optimizing a method for purifying microglia from the spinal cord facilitates the development of multiple studies focused on discovering microglia physiology. This protocol aims to describe a simple and highly reproducible extraction of the mouse spinal cord and the purification of microglia (Figure 1).

מחבר זרקור: מחקר מיקרוגליה על הטרוגניות וטיהור חוט השדרה 

העשרה מהירה ויעילה של תאי מיקרוגליה בחוט השדרה של עכבר

Our research focuses on the heterogeneity of microglia, which can exhibit both pro and anti-inflammatory behaviors across different pathologies and regions like the brain and spinal cord. We aim to enable a deeper understanding of spinal cord microglia behavior in diverse scenarios. The heterogeneity of microglia has made it difficult to classify them.This year, a new and broad classification has been proposed that goes beyond just a pro or anti-inflammatory status. Currently, achieving high purity and gel in isolating spinal cord microglia from animal models of neurological pathologies is a significant experiment and challenge. We identified a novel cytokine signaling pathway in the spinal cord microglia during chronic pain.Our protocol allows for a more controlled and somatic digestion, followed by a density gradient. Both result in less contamination by astrocytes compared to currently employed techniques for the purification of microglia from the spinal cord, brain, or embryos.

עיכול אנזימטי באמצעות רקמת חוט השדרה של עכבר בוצע באמצעות תערובת מועשרת מאוד בקולגנאז ותרמוליזין. הרקמה המעוכלת שנוצרה עברה מעבר דרך מסנן של 40 מיקרומטר כדי לחסל חומר לא מעוכל. התאים שנאספו הועשרו באמצעות שיפוע צפיפות פרקול, עם 90% בחלק התחתון ו-45% בחלק העליון. התאים המועשרים במיקרוגליה בתוך...

Watch this Scientific Journal Video about Microglia Research on Spinal Cord Heterogeneity and Purification at JoVE.com

מיקרוגליה נחשבים לחלק מהתאים הרבגוניים ביותר בגוף, המסוגלים להסתגלות מורפולוגית ותפקודית. ההטרוגניות והרב-תכליתיות שלהם מאפשרות שמירה על הומאוסטזיס מוחי, תוך שהם קשורים גם לפתולוגיות נוירולוגיות שונות. כאן מתוארת טכניקה לטיהור מיקרוגליה של חוט השדרה.

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and ...

המחקר שלנו מתמקד בהטרוגניות של תאי מיקרוגליה, אשר יכולים להפגין התנהגויות פרו-דלקתיות ונוגדות דלקת על פני פתולוגיות ואזורים שונים כמו המוח וחוט השדרה. אנו שואפים לאפשר הבנה עמוקה יותר של התנהגות תאי מיקרוגליה בחוט השדרה בתרחישים מגוונים. ההטרוגניות של מיקרוגליה הקשתה על סיווגם .השנה הוצע סיווג חדש ורחב החורג מעבר לסטטוס פרו או אנטי דלקתי בלבד. כיום, השגת טוהר וג'ל גבוהים בבידוד מיקרוגליה של חוט השדרה ממודלים של בעלי חיים של פתולוגיות נוירולוגיות היא ניסוי ואתגר משמעותי. זיהינו מסלול איתות ציטוקינים חדשני במיקרוגליה של חוט השדרה במהלך כאב כרוני.הפרוטוקול שלנו מאפשר עיכול מבוקר וסומטי יותר, ואחריו שיפוע צפיפות. שתיהן גורמות לפחות זיהום על ידי אסטרוציטים בהשוואה לטכניקות המשמשות כיום לטיהור תאי מיקרוגליה מחוט השדרה, המוח או העוברים.

rapid-and-efficient-enrichment-of-mouse-spinal-cord-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Rapid and Efficient Enrichment of Mouse Spinal Cord Microglia

1.3K Views.  Mexico Children's Hospital. המחקר שלנו מתמקד בהטרוגניות של תאי מיקרוגליה, אשר יכולים להפגין התנהגויות פרו-דלקתיות ונוגדות דלקת על פני פתולוגיות ואזורים שונים כמו המוח וחוט השדרה. אנו שואפים לאפשר הבנה עמוקה יותר של התנהגות תאי מיקרוגליה בחוט השדרה בתרחישים מגוונים. ההטרוגניות של מיקרוגליה הקשתה על ?...

Video: מחבר זרקור: מחקר מיקרוגליה על הטרוגניות וטיהור חוט השדרה 

The vertebral column defines a vertebrate and shapes the spinal canal, a cavity that encloses and safeguards the spinal cord. Proper development and function of the mammalian central nervous system rely significantly on the activity of resident macrophages known as microglia. Microglia display heterogeneity and multifunctionality, enabling distinct gene expression and behavior within the spinal cord and brain. Numerous studies have explored cerebral microglia function, detailing purification methods extensively. However, the purification of microglia from the spinal cord in mice lacks a comprehensive description. In contrast, the utilization of a highly purified collagenase, as opposed to an unrefined extract, lacks reporting within central nervous system tissues. In this study, the vertebral column and spinal cord were excised from 8-10 week-old C57BL/6 mice. Subsequent digestion employed a highly purified collagenase, and microglia purification utilized a density gradient. Cells underwent staining for flow cytometry, assessing viability and purity through CD11b and CD45 staining. Results yielded an average viability of 80% and a mean purity of 95%. In conclusion, manipulation of mouse microglia involved digestion with a highly purified collagenase, followed by a density gradient. This approach effectively produced substantial spinal cord microglia populations.

Microglia are regarded as some of the most versatile cells in the body, capable of morphological and functional adaptation. Their heterogeneity and multifunctionality enable the maintenance of brain homeostasis, while also being linked to various neurological pathologies. Here, a technique for purifying spinal cord microglia is described.

Liberase-Based Enzymatic Purification of Microglial Cells Isolated from a Mouse Spinal Cord

To begin, with a scalpel, make an incision along the dorsal midline of a euthanized mouse from the occipital to the sacral region. Using a stereoscopic surgical microscope, carefully dissect through layers until the lumbar spine. Identify the last costal arch.Identify the last cervical vertebra and the sacrum. Then make a cut to separate the spine. With a pair of dissecting forceps, perform a dorsal laminectomy of the vertebra to extract the spinal cord.Remove the nerves emerging through the foramina which constitute the peripheral nervous system. Now, place the extracted spinal cord on a dissecting board. With a pair of vannas scissors, cut it into two-millimeter sized pieces.Then transfer the pieces to a two-milliliter flat-bottomed microtube. Add one milliliter of HBSS-LD working solution to the microtube. Incubate the mixture at 37 degrees Celsius for 25 minutes.Make sure to vigorously vortex the mixture every five minutes. Next, pass the contents of each digestion through a 40-micron-size strainer. Then add seven milliliters of HBSS with 2%FBS to neutralize the digestion and crush the remaining tissue.Transfer the suspension to a 50-milliliter conical tube before centrifuging it at 220 g for five minutes at four degrees Celsius. Now use a one-milliliter micropipette to discard the supernatant. Then resuspend the pellet in two milliliters of HBSS-FBS in a new 15-milliliter conical tube.Add two milliliters of 90%isotonic density gradient medium to the tube, and centrifuge the mixture at 160 g for 25 minutes at 18 degrees Celsius. Finally, with a transfer pipette, retrieve the interphase and transfer it to a 15-milliliter conical tube. Wash the cells with 10 milliliters of PBS, then centrifuge the cells at 220 g for five minutes at five degrees Celsius before further experimentation.The purification of the extracted microglial cells yielded up to 99%cell yield as confirmed by FACS staining. Double positive cells with an average size of 10 micrometers consistent with nonactivated microglia were observed.