Laboratuvarımız temel bilgiler ve translasyonel sinirbilim üzerine odaklanmaktadır. Epilepsi araştırmalarındaki güçlü temeli nöroproteksiyon, nöroinflamasyon ve nörorejenerasyondaki yenilikçi yaklaşımlarla birleştiriyor. Yapay zeka, gelişmiş E makinesi ve genetik aracını Planaria gibi yenilikçi modellerle birleştiren nöromodülasyon cihazları, temel nöbet mekanizmalarını incelemek için manzarayı dönüştürmek için umut vaat ediyor.
Deneysel nöbet modelleri, epilepsinin mekanizmalarını anlamak ve potansiyel tedavileri test etmek için çok değerlidir. Bununla birlikte, nöbetlerin biyolojisinin sınırlı anlaşılması, omurgasız modellerinde insan ve minimal nöbet mekanizmalarının karmaşıklığı, davranış ve nörofizyolojik tepkiler için standartlaştırılmış protokollerin sınırı ve farklı modellerde ilaç etkinliği nedeniyle translasyonel etkilerini kısıtlayan çeşitli zorluklar devam etmektedir. Ele aldığımız bir boşluk, doza bağımlı, pilokarpin kaynaklı planarya davranışı ile sinir sistemindeki müteakip değişiklikler arasındaki ilişkidir, immünofloresan ve golgi boyama teknikleriyle histolojik olarak görselleştirilir.
Planaryalar, deneysel nöbetler için uygun maliyetli ve etik açıdan uygun modeller olarak hizmet eder. Diğer omurgasızlardan veya zebra balıklarından farklı olarak, planaryalar nöronları yeniler ve farklı davranış fenotipleri sergiler ve nöbet önleyici ilaç testi için değerlerini artırır. Basitlikleri ve nöromekanizmaların korunması, temel araştırmalar ve translasyonel epilepsi çalışmaları arasında köprü kurar.
Planaryalar, bilateral simetri ensefalizasyonu, nörotransmitter sistemlerini koruma ve nörotoksik ve prokonvülsan ajanlara duyarlılıkları nedeniyle nöbet modelleri olarak hizmet eder. Bu çok yönlü model, omurgasızları ve memeli epilepsi modellerini birbirine bağlayarak translasyonel araştırmaları ve nöbet önleyici ilaç keşif çabalarını ilerletmektedir. Bulgular, nöbetin neden olduğu nöronal rejeneratif mekanizmaları, nöronal bağlantı değişikliklerini, daha geniş nörotoksisite araştırmalarını, nöbetlerden sonra genetik koruma ve ilaç tedavisini ve epilepsinin komorbiditesini incelemek için sosyal davranış planaryasını araştıran sorulara ilham veriyor.
Başlamak için, kaynak suyunda çözünmüş bir ve iki milimolar konsantrasyonlarda iki pilokarpin çözeltisi hazırlayın. Her çözeltiden üç mililitreyi 4 X 3 oyuklu bir plakanın ayrı sıralarına pipetleyin. Açıklığı planaryaya zarar vermeden sığacak kadar büyük yapmak için bir pipet ucu kesin.
Kesilmiş uçlu bir transfer pipeti kullanarak, 12 kuyucuğun her birine laboratuvarda yetiştirilmiş, iki haftalık bir Dugesia dorotocephala yerleştirin. Normal iç mekan aydınlatma koşullarında plakanın üzerine bir kamera yerleştirin ve planaryanın davranışını bir saat boyunca kaydedin. Golgi boyama için, ötenazi planaryayı golgi boyama kitinden A ve B çözeltilerinin bire bir karışımı ile doldurulmuş bir beher veya petri kabına yerleştirin.
Ertesi gün, planaryayı taze bir A ve B çözeltisi karışımı ile doldurulmuş yeni bir behere aktarın. Ertesi gün çözelti C'yi değiştirdikten sonra, planaryayı en az 72 saat ve çözelti C'de bir haftaya kadar bekletin. Bir transfer pipeti kullanarak, planaryayı çözelti C'den çıkarın ve bir ayna üzerine az miktarda OCT bileşiğine gömün. Bunları OCT bileşiği ile dikkatlice çevreleyin ve eksi 24 santigrat dereceye ayarlanmış bir kriyostat makinesi kullanarak gömülü planaryayı enine beş mikrometrelik bölümlere kesin.
Bir transfer pipeti kullanarak, planarya bölümlerini C çözeltisi ile jelatin kaplı slaytlara monte edin. Slaytları karanlıkta oda sıcaklığında üç güne kadar kurumaya bırakın. Slaytları lekelemek için, sırayla boyama ve yıkama solüsyonlarına batırın. Parlak alan mikroskobu altında gözlemlemeden önce slaytları histolojik montaj ortamı ve bir kapak fişi kullanarak örtün.
Bir ila altı milimolar pilokarpin ile tedavi edilen Dugesia dorotocephala elde edin. Planarya ötenazi yapıldıktan sonra, en az 24 saat boyunca% 4 paraformaldehit içine yerleştirin. Daha sonra, planaryayı% 20 sükroza aktarın ve bir gün boyunca çözelti içinde bırakın.
Her biri beş dakika boyunca PBS'de üç ila dört kez durulayın. Yıkadıktan sonra, lekelenmeye hazır olana kadar saklamak için taze% 20 sükroza aktarın. Şimdi, planaryayı belirli bir süre için uygun çözümlere sırayla yerleştirin.
Daha sonra, planaryayı bir saat boyunca süt tozu ile bloke edin ve tüpü gece boyunca birincil antikor çözeltisinde dört santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, planaryayı PBS'de 10 dakika durulayın. Keçi anti-fare IgG ikincil antikorunu PBS'de mililitrede bir mikrograma seyreltin ve planarya tüpünü antikor çözeltisi ile gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin.
Yıkadıktan sonra, tüm planaryayı sürgünün üzerine monte edin. Solucanları bir kapak fişi ile örtün. Bunları sulu montaj ortamı ile kapatın ve slaytı floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
Başlamak için, golgi ve immün boyamadan sonra planarya görüntülerini elde edin. Açık kaynaklı görüntü analizi yazılımı uygulamasını başlatın ve uygulamaya color deconvolution2 jar eklentisini yükleyin. Analiz etmek için görüntüyü seçin ve açık kaynaklı görüntü analizi yazılımı uygulamasına sürükleyin.
Görüntü sekmesine gidin, renk'e tıklayın ve renk dekonvolüsyon2 sürüm 2.1'i seçin. Vektörler seçeneğinde H DAB'a tıklayın ve çıktı seçeneğinde 8bit Geçirgenlik'e tıklayın. Simülasyon LUT'larının renk 3 için çapraz ürün, matrisleri göster ve göstergeyi gizle seçeneklerinin tümünün seçili olduğundan emin olun ve ardından Tamam'a tıklayın.
Açık kaynaklı görüntü analizi yazılım uygulamasının etkili bir şekilde analiz edebildiğini doğrulamak için siyah beyaz görüntüyü seçin. Şimdi, görüntü sekmesine gidin. Ayarla'ya tıklayın ve eşiği seçin.
Eşiği, DAB boyaması veya ön plan beyaz bir arka planla okunacak şekilde ayarlayın. Analiz et'i tıklayın, ardından ölçümleri ayarlayın. Alanı, minimum ve maksimum gri değeri, eşik sınırını, görüntüleme etiketini, medyanı ve ortalama gri değeri seçin ve Tamam'ı tıklayın.
Ardından sonuçları elde etmek için analiz et'i ve ardından ölç'ü tıklayın. Son olarak, sonuç görüntüsüne tıklayın, ardından dosyaya tıklayın ve sonuçları kaydetmek için farklı kaydet'i seçin. Salınımlar ve hareketler, kontrole kıyasla altı milimolar, pilokarpin ile tedavi edilen planaryada arttırıldı.
Üç milimolar pilokarpine maruz kalan planarya, kontrol grubuna kıyasla kuyuların merkezinde önemli ölçüde daha fazla zaman geçirdi. Altı milimolar pilokarpin ile tedavi edilen planarya, çevrede hem kontrol hem de üç milimolar gruplardan daha fazla zaman geçirdi. Altı milimolar pilokarpin tedavisi, kontrole kıyasla nöral yapıların sayısını önemli ölçüde azalttı.
