Unser Labor konzentriert sich auf Grundlagen und translationale Neurowissenschaften. Es kombiniert eine solide Grundlage in der Epilepsieforschung mit innovativen Ansätzen in den Bereichen Neuroprotektion, Neuroinflammation und Neuroregeneration. Die Kombination von KI, fortschrittlicher E-Maschine und Genetik-Tool mit innovativen Modellen wie einem Planaria-Neuromodulationsgerät ist vielversprechend, um die Landschaft zu verändern und grundlegende Anfallsmechanismen zu untersuchen.
Experimentelle Anfallsmodelle sind sehr wertvoll, um die Mechanismen der Epilepsie zu verstehen und mögliche Therapien zu testen. Es gibt jedoch nach wie vor einige Herausforderungen, die ihre translationale Wirkung aufgrund des begrenzten Verständnisses der Biologie von Anfällen, der Komplexität menschlicher und minimaler Anfallsmechanismen in wirbellosen Modellen, der Grenzen standardisierter Protokolle für Verhalten und neurophysiologische Reaktionen und der Wirksamkeit von Medikamenten in verschiedenen Modellen einschränken. Eine Lücke, die wir schließen, ist die Beziehung zwischen dosisabhängigem, Pilocarpin-induziertem Planarienverhalten und nachfolgenden Veränderungen in ihrem Nervensystem, die histologisch mit Immunfluoreszenz- und Golgi-Färbetechniken sichtbar gemacht werden.
Planarien dienen als kosteneffiziente und ethisch günstige Modelle für experimentelle Anfälle. Im Gegensatz zu anderen wirbellosen Tieren oder Zebrafischen regenerieren Planarien Neuronen und weisen unterschiedliche Verhaltensphänotypen auf, was ihren Wert für Medikamententests gegen Krampfanfälle erhöht. Ihre Einfachheit und die Erhaltung der Neuromechanismen schlagen eine Brücke zwischen Grundlagenforschung und translationalen Epilepsiestudien.
Planarien dienen aufgrund ihrer bilateralen Symmetrie-Enzephalisierung, ihrer konservierenden Neurotransmittersysteme und ihrer Empfindlichkeit gegenüber neurotoxischen und prokonvulsiven Wirkstoffen als Anfallsmodelle. Dieses vielseitige Modell verbindet die Modelle von Wirbellosen und Säugetieren und treibt die translationale Forschung und die Wirkstoffforschung gegen Krampfanfälle voran. Die Ergebnisse regen Fragen zur Untersuchung von anfallsinduzierten neuronalen Regenerationsmechanismen, Veränderungen der neuronalen Konnektivität, breiterer Neurotoxizitätsforschung, genetischer Konservierung und Medikation nach Anfällen sowie der Sozialverhaltensplanarien zur Untersuchung der Komorbidität von Epilepsie an.
Bereiten Sie zunächst zwei Lösungen von Pilocarpin in Konzentrationen von einem und zwei Millimolaren vor, die in Quellwasser gelöst sind. Pipettieren Sie drei Milliliter jeder Lösung in separate Reihen einer 4 x 3-Well-Platte. Schneiden Sie eine Pipettenspitze ab, um die Öffnung groß genug zu machen, damit die Planarien hineinpassen, ohne sie zu beschädigen.
Geben Sie mit einer Transferpipette mit der abgeschnittenen Spitze eine im Labor gezüchtete, zwei Wochen alte Dugesia dorotocephala in jede der 12 Vertiefungen. Positionieren Sie eine Kamera unter normalen Lichtverhältnissen in Innenräumen über der Platte und zeichnen Sie das Verhalten der Planarien eine Stunde lang auf. Für die Golgi-Färbung legen Sie euthanasierte Planarien in ein Becherglas oder eine Petrischale, die mit einer Eins-zu-Eins-Mischung aus den Lösungen A und B aus dem Golgi-Fleckenset gefüllt ist.
Am nächsten Tag werden die Planarien in ein neues Becherglas umgefüllt, das mit einer frischen Mischung aus den Lösungen A und B gefüllt ist. Die Planarien werden aus der Lösung entnommen und in Lösung C in ein anderes Becherglas gegeben. Lassen Sie die Planarien nach dem Austausch von Lösung C am nächsten Tag mindestens 72 Stunden und bis zu einer Woche in Lösung C ruhen. Entfernen Sie mit einer Transferpipette die Planarien aus Lösung C und betten Sie sie in eine kleine Menge OCT-Verbindung auf einem Futter ein. Umgeben Sie sie vorsichtig mit der OCT-Verbindung und schneiden Sie die eingebetteten Planarien mit einer Kryostatmaschine, die auf minus 24 Grad Celsius eingestellt ist, quer in Fünf-Mikrometer-Abschnitte.
Montieren Sie die Planarienschnitte mit einer Transferpipette auf mit Gelatine überzogene Objektträger mit Lösung C. Lassen Sie die Objektträger bis zu drei Tage lang im Dunkeln bei Raumtemperatur trocknen. Um die Objektträger zu färben, tauchen Sie sie nacheinander in Färbe- und Waschlösungen. Decken Sie die Objektträger mit dem histologischen Eindeckmedium und einem Deckglas ab, bevor Sie sie unter einem Hellfeldmikroskop betrachten.
Erhalten Sie Dugesia dorotocephala behandelt mit ein bis sechs millimolaren Pilocarpin. Nachdem die Planarien eingeschläfert wurden, legen Sie sie für mindestens 24 Stunden in 4%ige Paraformaldehyd. Übertragen Sie dann die Planarien auf 20%Saccharose und lassen Sie sie einen Tag lang in der Lösung.
Spülen Sie sie drei- bis viermal jeweils fünf Minuten lang in PBS aus. Nach dem Waschen in frische 20%ige Saccharose umfüllen, bis sie zum Färben bereit sind. Platzieren Sie nun die Planarien nacheinander für eine bestimmte Zeit in geeigneten Lösungen.
Blockieren Sie anschließend die Planarien für eine Stunde mit Milchpulver und inkubieren Sie das Röhrchen über Nacht bei vier Grad Celsius in der primären Antikörperlösung. Spülen Sie die Planarien am nächsten Tag 10 Minuten lang in PBS aus. Verdünnen Sie den Ziegen-Anti-Maus-IgG-Sekundärantikörper auf ein Mikrogramm pro Milliliter in PBS und inkubieren Sie das Planarienröhrchen über Nacht bei Raumtemperatur mit der Antikörperlösung.
Nach dem Waschen die ganze Planarien auf den Objektträger montieren. Decken Sie die Würmer mit einem Deckglas ab. Verschließen Sie diese mit wässrigen Eindeckmedien und betrachten Sie den Objektträger unter einem Fluoreszenzmikroskop.
Sammeln Sie zunächst Bilder von Planarien nach Golgi und Immunfärbung. Starten Sie die Open-Source-Bildanalyse-Softwareanwendung und installieren Sie das Color Deconvolution2 JAR-Plugin in der Anwendung. Wählen Sie das zu analysierende Bild aus und ziehen Sie es in die Open-Source-Bildanalysesoftware.
Gehen Sie zur Registerkarte Bild, klicken Sie auf Farbe und wählen Sie color deconvolution2 Version 2.1 aus. Klicken Sie in der Option Vektoren auf H DAB und in der Ausgabeoption auf 8-Bit-Durchlässigkeit. Stellen Sie sicher, dass simulierte LUTs das Produkt für Farbe 3 kreuzen, Matrizen anzeigen und Legende ausblenden ausgewählt sind, und klicken Sie dann auf OK.
Wählen Sie das Schwarzweißbild aus, um zu bestätigen, dass die Open-Source-Bildanalysesoftware es effektiv analysieren kann. Gehen Sie nun zur Registerkarte Bild. Klicken Sie auf Anpassen und wählen Sie den Schwellenwert aus.
Passen Sie den Schwellenwert so an, dass die DAB-Färbung oder der Vordergrund mit einem weißen Hintergrund gelesen wird. Klicken Sie auf "Analysieren" und dann auf "Messungen". Wählen Sie den Bereich, den minimalen und maximalen Grauwert, die Begrenzung auf den Schwellenwert, die Anzeigebeschriftung, den Median und den mittleren Grauwert aus und klicken Sie auf OK.
Klicken Sie dann auf Analysieren und dann auf Messen, um die Ergebnisse zu erhalten. Klicken Sie abschließend auf das Ergebnisbild, dann auf Datei und wählen Sie Speichern unter, um die Ergebnisse zu speichern. Die Oszillationen und Flicks waren bei sechs millimolaren, mit Pilocarpin behandelten Planarien im Vergleich zur Kontrolle erhöht.
Planarien, die drei millimolaren Pilocarpinen ausgesetzt waren, verbrachten im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant mehr Zeit im Zentrum der Vertiefungen. Planarien, die mit sechsmillimolaren Pilocarpinen behandelt wurden, verbrachten mehr Zeit im Perimeter als sowohl die Kontroll- als auch die Drei-Millimolar-Gruppe. Die Behandlung mit sechsmillimolaren Pilocarpinen reduzierte die Anzahl der neuronalen Strukturen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant.
