Notre laboratoire se concentre sur les neurosciences fondamentales et translationnelles. Il combine des bases solides dans la recherche sur l’épilepsie avec des approches innovantes en matière de neuroprotection, de neuroinflammation et de neurorégénération. La combinaison de l’IA, d’une machine E avancée et d’un outil génétique avec des modèles innovants, comme un dispositif de neuromodulation Planaria, est prometteuse pour transformer le paysage afin d’étudier les mécanismes de base des crises.
Les modèles expérimentaux de crises sont très précieux pour comprendre les mécanismes de l’épilepsie et tester des thérapies potentielles. Cependant, plusieurs défis persistent et limitent leur impact translationnel en raison de la compréhension limitée de la biologie des crises, de la complexité des mécanismes de crise humaine et minimale dans les modèles d’invertébrés, de la limite des protocoles standardisés pour le comportement et les réponses neurophysiologiques et de l’efficacité des médicaments dans différents modèles. Une lacune que nous abordons est la relation entre le comportement planaire induit par la pilocarpine et les changements ultérieurs de leur système nerveux visualisés histologiquement avec des techniques d’immunofluorescence et de coloration de Golgi.
Les planaires servent de modèles rentables et éthiquement favorables pour les crises expérimentales. Contrairement à d’autres invertébrés ou poissons-zèbres, les planaires régénèrent les neurones et présentent différents phénotypes de comportement, ce qui augmente leur valeur pour les tests de médicaments anti-épileptiques. Leur simplicité et la conservation des neuromécanismes font le lien entre la recherche fondamentale et les études translationnelles sur l’épilepsie.
Les planaires servent de modèles de crise en raison de leur encéphalisation bilatérale symétrique, de leur conservation des systèmes de neurotransmetteurs et de leur sensibilité aux agents neurotoxiques et proconvulsivants. Ce modèle polyvalent relie les modèles d’invertébrés et d’épilepsie des mammifères, faisant progresser la recherche translationnelle et les efforts de découverte de médicaments anti-épileptiques. Les résultats suscitent des questions sur les mécanismes de régénération neuronale induits par les crises, les changements de connectivité neuronale, la recherche plus large sur la neurotoxicité, la préservation génétique et la médication après les crises, et les planaires du comportement social pour étudier la comorbidité de l’épilepsie.
Pour commencer, préparez deux solutions de pilocarpine à des concentrations d’un et deux millimolaires dissoutes dans de l’eau de source. Pipeter trois millilitres de chaque solution en rangées séparées d’une plaque de 4 X 3 puits. Coupez une pointe de pipette pour que l’ouverture soit suffisamment grande pour s’adapter aux planaires sans l’endommager.
À l’aide d’une pipette de transfert avec la pointe coupée, placez un Dugesia dorotocephala de deux semaines, élevé en laboratoire, dans chacun des 12 puits. Placez une caméra sur la plaque dans des conditions normales d’éclairage intérieur et enregistrez le comportement de la planaire pendant une heure. Pour la coloration au golgi, placez les planaires euthanasiés dans un bécher ou une boîte de Pétri remplie d’un mélange individuel des solutions A et B du kit de coloration au golgi.
Le lendemain, transférez les planaires dans un nouveau bécher rempli d’un nouveau mélange de solutions A et B.Retirez les planaires de la solution et placez-les dans la solution C dans un autre bécher. Après avoir remplacé la solution C le lendemain, laissez reposer les planaires pendant au moins 72 heures et jusqu’à une semaine dans la solution C. À l’aide d’une pipette de transfert, retirez les planaires de la solution C et incorporez-y une petite quantité de composé OCT sur un mandrin. Encerclez-les soigneusement avec le composé OCT et coupez transversalement les planaires encastrés en sections de cinq micromètres à l’aide d’une machine cryostat réglée à moins 24 degrés Celsius.
À l’aide d’une pipette de transfert, montez les sections de planaire sur des lames recouvertes de gélatine avec la solution C.Laissez sécher les lames à l’obscurité à température ambiante jusqu’à trois jours. Pour tacher les lames, immergez-les séquentiellement dans des solutions de coloration et de lavage. Couvrez les lames à l’aide du support de montage histologique et d’une lamelle avant de l’observer au microscope à fond clair.
Obtenir Dugesia dorotocephala traité avec une à six millimolaires de pilocarpine. Une fois les planaires euthanasiés, placez-les dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 24 heures. Ensuite, transférez les planaires à 20 % de saccharose et laissez-les dans la solution pendant une journée.
Rincez-les trois à quatre fois dans du PBS pendant cinq minutes chacun. Après le lavage, transférez-les dans du saccharose frais à 20 % pour les conserver jusqu’à ce qu’ils soient prêts à teindre. Maintenant, placez les planaires séquentiellement dans des solutions appropriées pour un moment précis.
Ensuite, bloquez les planaires pendant une heure avec du lait en poudre et incubez le tube pendant la nuit à quatre degrés Celsius dans la solution d’anticorps primaire. Le lendemain, rincez les planaires au PBS pendant 10 minutes. Diluez l’anticorps secondaire IgG anti-souris de chèvre à un microgramme par millilitre dans du PBS et incubez le tube planaire avec la solution d’anticorps pendant la nuit à température ambiante.
Après le lavage, montez l’ensemble de la planaire sur la glissière. Couvrez les vers avec un lamelle. Scellez-les avec un support de montage aqueux et observez la lame au microscope fluorescent.
Pour commencer, obtenez des images de planaires après golgi et immunomarquage. Lancez l’application logicielle d’analyse d’images open source et installez le plug-in color deconvolution2 jar dans l’application. Sélectionnez l’image à analyser et faites-la glisser vers l’application logicielle d’analyse d’images open source.
Allez dans l’onglet image, cliquez sur couleur, puis sélectionnez color deconvolution2 version 2.1. Dans l’option vecteurs, cliquez sur H DAB et dans l’option de sortie, cliquez sur Transmittance 8 bits. Assurez-vous que les LUT simulées interproduit pour la couleur 3, les matrices d’affichage et le masquage de la légende sont tous sélectionnés, puis cliquez sur OK.
Sélectionnez l’image en noir et blanc pour confirmer que l’application logicielle d’analyse d’images open source peut l’analyser efficacement. Maintenant, allez dans l’onglet image. Cliquez sur ajuster et sélectionnez seuil.
Ajustez le seuil de sorte que la coloration DAB ou le premier plan soit lu sur un fond blanc. Cliquez sur analyser, puis sur Définir les mesures. Sélectionnez la zone, la valeur de gris minimale et maximale, la limite au seuil, l’étiquette d’affichage, la médiane et la valeur de gris moyenne, puis cliquez sur OK.
Cliquez ensuite sur analyser suivi de mesure pour obtenir les résultats. Enfin, cliquez sur l’image des résultats, puis sur Fichier et sélectionnez Enregistrer sous pour enregistrer les résultats. Les oscillations et les mouvements ont été augmentés chez les planaires de six millimolaires traités à la pilocarpine par rapport au témoin.
Les planaires exposés à la pilocarpine de trois millimolaires ont passé beaucoup plus de temps au centre des puits que le groupe témoin. Les planaires traités avec de la pilocarpine de six millimolaires ont passé plus de temps dans le périmètre que les groupes témoins et les groupes de trois millimolaires. Le traitement à la pilocarpine de six millimolaires a considérablement réduit le nombre de structures neuronales par rapport au contrôle.
