Nosso laboratório está se concentrando em noções básicas e neurociência translacional. Está combinando uma base sólida na pesquisa de epilepsia com abordagens inovadoras em neuroproteção, neuroinflamação e neuroregeneração. A combinação de IA, máquina E avançada e ferramenta genética com modelos inovadores, como dispositivos de neuromodulação Planaria, promete transformar a paisagem para estudar mecanismos básicos de convulsão.
Modelos experimentais de convulsões são muito valiosos para entender os mecanismos da epilepsia e testar possíveis terapias. No entanto, vários desafios persistem restringindo seu impacto translacional devido à compreensão limitada da biologia das convulsões, à complexidade dos mecanismos humanos e mínimos de convulsões em modelos de invertebrados, ao limite de protocolos padronizados para comportamento e respostas neurofisiológicas e eficácia de medicamentos em diferentes modelos. Uma lacuna que estamos abordando é a relação entre o comportamento da planária induzida pela pilocarpina dependente da dose e as alterações subsequentes em seu sistema nervoso visualizadas histologicamente com técnicas de imunofluorescência e coloração de golgi.
As planárias servem como modelos econômicos e eticamente favoráveis para convulsões experimentais. Ao contrário de outros invertebrados ou peixes-zebra, as planárias regeneram neurônios e exibem diferentes fenótipos de comportamento, aumentando seu valor para testes de drogas anticonvulsivantes. Sua simplicidade e conservação de neuromecanismos unem a pesquisa básica e os estudos translacionais de epilepsia.
As planárias servem como modelos de convulsão devido à sua encefalização de simetria bilateral, conservação de sistemas de neurotransmissores e sensibilidade a agentes neurotóxicos e pró-convulsivantes. Este modelo versátil conecta os modelos de epilepsia de invertebrados e mamíferos que avançam na pesquisa translacional e nos esforços de descoberta de medicamentos anticonvulsivantes. As descobertas inspiram questões que investigam mecanismos regenerativos neuronais induzidos por convulsões, alterações na conectividade neuronal, pesquisas mais amplas de neurotoxicidade, preservação genética e medicação após convulsões e a planária de comportamento social para estudar a comorbidade da epilepsia.
Para começar, prepare duas soluções de pilocarpina nas concentrações de um e dois milimolares dissolvidos em água de nascente. Pipete três mililitros de cada solução em fileiras separadas de uma placa de 4 X 3 poços. Corte uma ponta de pipeta para tornar a abertura grande o suficiente para caber na planária sem causar danos.
Usando uma pipeta de transferência com a ponta cortada, coloque uma Dugesia dorotocephala de duas semanas de idade criada em laboratório em cada um dos 12 poços. Posicione uma câmera sobre a placa em condições normais de iluminação interna e registre o comportamento da planária por uma hora. Para a coloração de golgi, coloque a planária eutanasiada em um béquer ou placa de Petri preenchida com uma mistura individual de soluções A e B do kit de coloração de golgi.
No dia seguinte, transferir a planária para um novo copo cheio de uma nova mistura das soluções A e B. Retirar a planária da solução e colocá-la na solução C noutro copo. Depois de substituir a solução C no dia seguinte, deixe a planária descansar por no mínimo 72 horas e até uma semana na solução C. Usando uma pipeta de transferência, remova a planária da solução C e embeba em uma pequena quantidade de composto OCT em um mandril. Cerque-os cuidadosamente com o composto OCT e corte transversalmente a planária embutida em seções de cinco micrômetros usando uma máquina de criostato ajustada para menos 24 graus Celsius.
Usando uma pipeta de transferência, monte as seções de planária em lâminas revestidas de gelatina com a solução C. Deixe as lâminas secarem no escuro em temperatura ambiente por até três dias. Para manchar as lâminas, mergulhe-as sequencialmente em soluções de coloração e lavagem. Cobrir as lâminas com o meio de montagem histológico e uma lamínula antes de as observar ao microscópio de campo claro.
Obter Dugesia dorotocephala tratada com pilocarpina de um a seis milimolares. Depois que as planárias forem sacrificadas, coloque-as em 4% de paraformaldeído por pelo menos 24 horas. Em seguida, transfira a planária para 20% de sacarose e deixe-a na solução por um dia.
Enxágue-os três a quatro vezes em PBS por cinco minutos cada. Após a lavagem, transfira-os para sacarose fresca a 20% para armazenamento até que estejam prontos para manchar. Agora, coloque a planária sequencialmente em soluções apropriadas por um tempo específico.
Em seguida, bloqueie a planária por uma hora com leite em pó e incube o tubo durante a noite a quatro graus Celsius na solução primária de anticorpos. No dia seguinte, enxágue a planária em PBS por 10 minutos. Diluir o anticorpo secundário IgG de cabra anti-ratinho para um micrograma por mililitro em PBS e incubar o tubo de planária com a solução de anticorpos durante a noite à temperatura ambiente.
Após a lavagem, monte toda a planária na lâmina. Cubra as minhocas com uma lamínula. Sele-os com meios de montagem aquosos e observe a lâmina sob um microscópio fluorescente.
Para começar, obtenha imagens de planárias após golgi e imunocoloração. Inicie o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto e instale o plug-in jar de deconvolução2 de cores no aplicativo. Selecione a imagem a ser analisada e arraste-a para o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto.
Vá para a guia de imagem, clique em cor e selecione deconvolução de cores2 versão 2.1. Na opção de vetores, clique em H DAB e na opção de saída, clique em Transmitância de 8 bits. Certifique-se de que as LUTs simuladas cruzem o produto para a cor 3, mostrar matrizes e ocultar legenda estejam todas selecionadas e clique em OK.
Selecione a imagem em preto e branco para confirmar se o aplicativo de software de análise de imagem de código aberto pode analisá-la com eficiência. Agora, vá para a guia de imagem. Clique em ajustar e selecione limite.
Ajuste o limite para que a coloração DAB ou o primeiro plano seja lido com um fundo branco. Clique em analisar e defina as medidas. Selecione a área, o valor mínimo e máximo de cinza, o limite até o limite, o rótulo de exibição, a mediana e o valor médio de cinza e clique em OK.
Em seguida, clique em analisar seguido de medida para obter os resultados. Por fim, clique na imagem de resultados, clique em arquivo e selecione salvar como para salvar os resultados. As oscilações e movimentos foram aumentados em planárias tratadas com pilocarpina de seis milimolares em comparação com o controle.
Planaria exposta à pilocarpina de três milimolares passou significativamente mais tempo no centro dos poços em comparação com o grupo controle. Planaria tratada com pilocarpina de seis milimolares passou mais tempo no perímetro do que os grupos controle e três milimolares. O tratamento com pilocarpina de seis milimolares reduziu significativamente o número de estruturas neurais em comparação com o controle.
