Наша лаборатория специализируется на основах и трансляционной нейронауке. Он сочетает в себе прочную основу в исследованиях эпилепсии с инновационными подходами в области нейропротекции, нейровоспаления и нейрорегенерации. Сочетание искусственного интеллекта, передовой Е-машины и инструментов генетики с инновационными моделями, такими как устройства нейромодуляции Planaria, обещают трансформировать ландшафт для изучения основных механизмов судорог.
Экспериментальные модели припадков очень ценны для понимания механизмов эпилепсии и тестирования потенциальных методов лечения. Тем не менее, существует ряд проблем, ограничивающих их трансляционное воздействие из-за ограниченного понимания биологии судорог, сложности механизмов судорог у человека и минимальных механизмов припадков в моделях беспозвоночных, ограниченности стандартизированных протоколов поведения и нейрофизиологических реакций, а также эффективности лекарств в различных моделях. Пробел, который мы рассматриваем, заключается в взаимосвязи между дозозависимым поведением планарий, индуцированных пилокарпином, и последующими изменениями в их нервной системе, визуализированными гистологически с помощью иммунофлуоресцентных методов и окрашивания по методу Гольджи.
Планарии служат экономически эффективными и этически благоприятными моделями для экспериментальных припадков. В отличие от других беспозвоночных или рыб данио-рерио, планарии регенерируют нейроны и демонстрируют различные фенотипы поведения, что повышает их ценность для тестирования противосудорожных препаратов. Их простота и сохранение нейромеханизмов связывают фундаментальные исследования и трансляционные исследования эпилепсии.
Планарии служат моделями судорог из-за их двусторонней симметрической энцефализации, сохранения нейротрансмиттерных систем и чувствительности к нейротоксическим и проконвульсирующим агентам. Эта универсальная модель объединяет модели эпилепсии у беспозвоночных и млекопитающих, продвигая трансляционные исследования и усилия по открытию противосудорожных препаратов. Полученные данные вызывают вопросы об изучении индуцированных припадками нейрональных регенеративных механизмов, изменений нейронных связей, более широких исследований нейротоксичности, генетической консервации и лечения после припадков, а также планарии социального поведения для изучения коморбидности эпилепсии.
Для начала приготовьте два раствора пилокарпина в концентрациях один и два миллимоляра, растворенных в родниковой воде. Пипеткой нанесите по три миллилитра каждого раствора в отдельные ряды луночной пластины 4 Х 3. Отрежьте кончик пипетки так, чтобы отверстие было достаточно большим, чтобы оно помещалось в планарии без повреждения.
С помощью передаточной пипетки с отрезанным наконечником поместите по одному выращенному в лаборатории двухнедельному сорту Dugesia dorotocephala в каждую из 12 лунок. Расположите камеру над пластиной при нормальных условиях освещения в помещении и записывайте поведение планарии в течение одного часа. Для окрашивания по методу Гольджи поместите усыпленные планарии в стакан или чашку Петри, наполненную смесью растворов А и В в соотношении один к одному из набора для окрашивания по методу Гольджи.
На следующий день переложите планарии в новую мензурку, наполненную свежей смесью растворов А и В. Извлеките планарии из раствора и поместите их в раствор С в другой стакан. После замены раствора C на следующий день оставьте планарии минимум на 72 часа и до одной недели в растворе C. С помощью переводной пипетки удалите планарии из раствора C и вставьте небольшое количество ОКТ-соединения в патрон. Аккуратно окружите их составом ОКТ и поперечно разрежьте встроенные планарии на пятимикрометровые участки с помощью криостата, настроенного на минус 24 градуса Цельсия.
С помощью переводной пипетки закрепите секции планарий на предметные стекла, покрытые желатином, с раствором С. Дайте предметным стеклам высохнуть в темноте при комнатной температуре в течение трех дней. Чтобы испачкать предметные стекла, погрузите их последовательно в растворы для окрашивания и стирки. Накройте предметные стекла с помощью гистологических монтажных сред и покровного стекла перед рассмотрением под светлопольным микроскопом.
Получить Dugesia dorotocephala лечат пилокарпином от одного до шести миллимоляров. После того, как планарии будут усыплены, поместите их в 4% параформальдегид не менее чем на 24 часа. Далее переложите планарии на 20% сахарозы и оставьте их в растворе на одни сутки.
Промойте их три-четыре раза в PBS по пять минут каждый. После стирки переложите их в свежую 20%-ную сахарозу для хранения до готовности к окрашиванию. Теперь разместите планарии последовательно в соответствующих растворах на определенное время.
Затем закупорьте планарии на один час сухим молоком и инкубируйте пробирку в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия в растворе первичного антитела. На следующий день промойте планарии в PBS в течение 10 минут. Разведите козье вторичное антитело IgG к мышам до одного микрограмма на миллилитр в PBS и инкубируйте пробирку планарии с раствором антитела в течение ночи при комнатной температуре.
После промывки закрепите на горке всю планарию. Накройте червей покровным листом. Запечатайте их водными монтажными средами и понаблюдайте за предметным стеклом под флуоресцентным микроскопом.
Для начала получите снимки планарий после гольджи и иммуноокрашивания. Запустите программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом и установите в приложение плагин color deconvolution2 jar. Выберите изображение для анализа и перетащите его в программное приложение для анализа изображений с открытым исходным кодом.
Перейдите на вкладку изображения, нажмите цвет и выберите цветовую деконволюцию2 версии 2.1. В параметре векторов нажмите H DAB, а в параметре вывода нажмите 8bit Transmittance. Убедитесь, что смоделированные таблицы LUT являются перекрестным произведением для цвета 3, отображения матриц и скрытия легенды, затем нажмите кнопку ОК.
Выберите черно-белое изображение, чтобы подтвердить, что программное обеспечение для анализа изображений с открытым исходным кодом может эффективно его анализировать. Теперь перейдите на вкладку изображений. Нажмите «Настроить» и выберите пороговое значение.
Отрегулируйте порог так, чтобы окрашивание DAB или передний план читались на белом фоне. Нажмите «Анализировать», затем задайте измерения. Выберите площадь, минимальное и максимальное значение серого, ограничение до порога, отображение метки, медианы и среднего значения серого и нажмите кнопку ОК.
Затем нажмите «Анализировать», а затем «Измерить», чтобы получить результаты. Наконец, нажмите на изображение результатов, затем нажмите «Файл» и выберите «Сохранить как», чтобы сохранить результаты. Колебания и щелчки были увеличены в шестимиллимолярных планариях, обработанных пилокарпином, по сравнению с контролем.
Планарии, подвергшиеся воздействию трехмиллимолярного пилокарпина, проводили значительно больше времени в центре лунок по сравнению с контрольной группой. Планарии, обработанные шестимиллимолярным пилокарпином, проводили больше времени в периметре, чем контрольная и трехмиллимолярная группы. Шестимиллимолярное лечение пилокарпином значительно уменьшало количество нервных структур по сравнению с контролем.
