Nuestro laboratorio se centra en los conceptos básicos y la neurociencia traslacional. Combina una base sólida en la investigación de la epilepsia con enfoques innovadores en neuroprotección, neuroinflamación y neuroregeneración. La combinación de IA, máquina E avanzada y herramienta genética con modelos innovadores, como los dispositivos de neuromodulación Planaria, prometen transformar el panorama para estudiar los mecanismos básicos de las convulsiones.
Los modelos experimentales de convulsiones son muy valiosos para comprender los mecanismos de la epilepsia y probar posibles terapias. Sin embargo, persisten varios desafíos que restringen su impacto traslacional debido a la comprensión limitada de la biología de las convulsiones, la complejidad de los mecanismos humanos y mínimos de convulsiones en modelos de invertebrados, el límite de los protocolos estandarizados para el comportamiento y las respuestas neurofisiológicas y la eficacia de los fármacos en diferentes modelos. Una brecha que estamos abordando es la relación entre el comportamiento de las planarias inducidas por pilocarpina dependientes de la dosis y los cambios posteriores en su sistema nervioso visualizado histológicamente con técnicas de inmunofluorescencia y tinción de Golgi.
Las planarias sirven como modelos rentables y éticamente favorables para las incautaciones experimentales. A diferencia de otros invertebrados o peces cebra, las planarias regeneran neuronas y exhiben diferentes fenotipos de comportamiento, lo que aumenta su valor para las pruebas de drogas anticonvulsivas. Su simplicidad y la conservación de los neuromecanismos unen la investigación básica y los estudios traslacionales de la epilepsia.
Las planarias sirven como modelos de convulsiones debido a su encefalización de simetría bilateral, conservan los sistemas de neurotransmisores y la sensibilidad a los agentes neurotóxicos y proconvulsivos. Este modelo versátil conecta los modelos de epilepsia de invertebrados y mamíferos, avanzando en la investigación traslacional y los esfuerzos de descubrimiento de fármacos anticonvulsivos. Los hallazgos inspiran preguntas que investigan los mecanismos de regeneración neuronal inducidos por las convulsiones, los cambios en la conectividad neuronal, la investigación más amplia sobre la neurotoxicidad, la preservación genética y la medicación después de las convulsiones, y las planarias de comportamiento social para estudiar la comorbilidad de la epilepsia.
Para comenzar, prepare dos soluciones de pilocarpina en concentraciones de uno y dos milimolares disueltos en agua de manantial. Pipetee tres mililitros de cada solución en filas separadas de una placa de pocillos de 4 X 3. Corte la punta de una pipeta para que la abertura sea lo suficientemente grande como para que quepan las planarias sin causar daños.
Usando una pipeta de transferencia con la punta cortada, coloque una Dugesia dorotocephala de dos semanas de edad criada en laboratorio en cada uno de los 12 pocillos. Coloque una cámara sobre la placa en condiciones normales de iluminación interior y registre el comportamiento de la planaria durante una hora. Para la tinción de Golgi, coloque planarias eutanasiadas en un vaso de precipitados o una placa de Petri llena con una mezcla uno a uno de las soluciones A y B del kit de tinción de Golgi.
Al día siguiente, transfiera las planarias a un nuevo vaso de precipitados lleno de una mezcla fresca de las soluciones A y B. Retire las planarias de la solución y colóquelas en la solución C de otro vaso de precipitados. Después de reemplazar la solución C al día siguiente, deje reposar las planarias durante un mínimo de 72 horas y hasta una semana en la solución C. Con una pipeta de transferencia, retire las planarias de la solución C e insértelas en una pequeña cantidad de compuesto OCT en un mandril. Rodéelos cuidadosamente con el compuesto OCT y corte transversalmente las planarias incrustadas en secciones de cinco micrómetros usando una máquina de criostato ajustada a menos 24 grados Celsius.
Con una pipeta de transferencia, monte las secciones planarias en portaobjetos recubiertos de gelatina con la solución C. Deje que los portaobjetos se sequen en la oscuridad a temperatura ambiente durante un máximo de tres días. Para teñir los portaobjetos, sumérjalos secuencialmente en soluciones de tinción y lavado. Cubra los portaobjetos con los medios de montaje histológico y un cubreobjetos antes de observarlos con un microscopio de campo claro.
Obtener Dugesia dorotocephala tratada con pilocarpina de uno a seis milimolares. Después de que las planarias sean sacrificadas, colóquelas en paraformaldehído al 4% durante al menos 24 horas. A continuación, transfiera las planarias a un 20% de sacarosa y déjelas en la solución durante un día.
Enjuáguelos tres o cuatro veces en PBS durante cinco minutos cada uno. Después de lavarlos, transfiéralos a sacarosa fresca al 20% para almacenarlos hasta que estén listos para manchar. Ahora, coloque las planarias secuencialmente en soluciones apropiadas para un tiempo específico.
A continuación, bloquee las planarias durante una hora con leche en polvo e incube el tubo durante la noche a cuatro grados centígrados en la solución primaria de anticuerpos. Al día siguiente, enjuague las planarias en PBS durante 10 minutos. Diluir el anticuerpo secundario IgG anti-ratón de cabra a un microgramo por mililitro en PBS e incubar el tubo de planaria con la solución de anticuerpos durante la noche a temperatura ambiente.
Después del lavado, monte toda la planaria en la corredera. Cubra los gusanos con un cubreobjetos. Séllelos con medios de montaje acuosos y observe el portaobjetos bajo un microscopio fluorescente.
Para empezar, obtenga imágenes de las planarias después de Golgi y la inmunotinción. Inicie la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto e instale el complemento jar deconvolution2 color en la aplicación. Seleccione la imagen que desea analizar y arrástrela a la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto.
Vaya a la pestaña de imagen, haga clic en color y seleccione deconvolución2 de color versión 2.1. En la opción vectores, haga clic en H DAB y en la opción de salida, haga clic en Transmitancia de 8 bits. Asegúrese de que las LUT simuladas cruzan el producto para el color 3, muestran matrices y ocultan leyenda estén seleccionadas y, a continuación, haga clic en Aceptar.
Seleccione la imagen en blanco y negro para confirmar que la aplicación de software de análisis de imágenes de código abierto puede analizarla de manera efectiva. Ahora, ve a la pestaña de la imagen. Haga clic en ajustar y seleccione el umbral.
Ajuste el umbral para que la tinción de DAB o el primer plano se lea con un fondo blanco. Haga clic en analizar y, a continuación, en establecer mediciones. Seleccione el área, el valor de gris mínimo y máximo, el límite al umbral, la etiqueta de visualización, la mediana y el valor medio de gris, y haga clic en Aceptar.
A continuación, haga clic en analizar seguido de medir para obtener los resultados. Finalmente, haga clic en la imagen de resultados, luego haga clic en archivo y seleccione guardar como para guardar los resultados. Las oscilaciones y movimientos se incrementaron en las planarias tratadas con pilocarpina de seis milimolares en comparación con el control.
Las planarias expuestas a pilocarpina de tres milimolares pasaron significativamente más tiempo en el centro de los pocillos en comparación con el grupo de control. Las planarias tratadas con pilocarpina de seis milimolares pasaron más tiempo en el perímetro que los grupos control y de tres milimolares. El tratamiento con pilocarpina de seis milimolares redujo significativamente el número de estructuras neuronales en comparación con el control.
