研究室では、基礎科学とトランスレーショナルニューロサイエンスに焦点を当てています。てんかん研究の強力な基盤と、神経保護、神経炎症、神経再生の革新的なアプローチを組み合わせています。AI、高度なEマシン、遺伝学ツールをPlanaria神経調節デバイスなどの革新的なモデルと組み合わせることで、基本的な発作メカニズムを研究するための風景を変えることが期待されています。
実験的発作モデルは、てんかんのメカニズムを理解し、潜在的な治療法をテストするために非常に価値があります。しかし、発作の生物学に関する理解が限られていること、無脊椎動物モデルにおけるヒトの発作メカニズムと最小限の発作メカニズムの複雑さ、行動と神経生理学的反応の標準化されたプロトコルの限界、および異なるモデル間での薬効のために、いくつかの課題が依然としてその翻訳影響を抑制しています。私たちが取り組んでいるのは、用量依存的なピロカルピン誘発性プラナリアの行動と、その後の神経系の変化との関係を免疫蛍光法やゴルジ染色法で組織学的に可視化することです。
プラナリアは、実験的発作の費用対効果が高く、倫理的に有利なモデルとして機能します。他の無脊椎動物やゼブラフィッシュとは異なり、プラナリアはニューロンを再生し、さまざまな行動表現型を示すため、抗てんかん薬検査の価値が高まります。その簡便さと神経メカニズムの保存は、基礎研究とトランスレーショナルてんかん研究の橋渡しをしています。
プラナリアは、左右対称性脳化、神経伝達物質系の保存、および神経毒性および痙攣誘発薬に対する感受性により、発作モデルとして機能します。この汎用性の高いモデルは、無脊椎動物と哺乳類のてんかんモデルを結びつけ、トランスレーショナルリサーチと抗てんかん薬の創薬の取り組みを推進します。この知見は、てんかんの併存疾患を研究するための、発作誘発性ニューロンの再生メカニズム、ニューロンの接続性の変化、広範な神経毒性研究、発作後の遺伝子保存と投薬、および社会的行動プラナリアを調査するための疑問を刺激するものである。
まず、湧き水に溶解した1ミリモルと2ミリモルの濃度でピロカルピンの2つの溶液を準備します。各溶液の3ミリリットルを4 X 3ウェルプレートの別々の列にピペットで移します。ピペットの先端をカットして、損傷を与えずにプラナリアにフィットするのに十分な大きさの開口部にします。
先端をカットしたトランスファーピペットを使用して、実験室で飼育された生後2週間のDugesia dorotocephalaを12個のウェルのそれぞれに入れます。通常の屋内照明条件下でカメラをプレートの上に置き、プラナリアの挙動を1時間記録します。ゴルジ染色の場合は、安楽死させたプラナリアを、ゴルジステインキットの溶液AとBの1対1の混合物で満たされたビーカーまたはペトリ皿に入れます。
翌日、プラナリアを溶液AとBの新しい混合物で満たされた新しいビーカーに移します。翌日に溶液Cを交換した後、プラナリアを溶液Cに最低72時間、最大1週間放置します.トランスファーピペットを使用して、溶液Cからプラナリアを除去し、チャックに少量のOCTコンパウンドを埋め込みます。OCTコンパウンドで丁寧に囲み、マイナス24°Cに設定したクライオスタットマシンで、埋め込まれたプラナリアを横方向に5マイクロメートルに切ります。
トランスファーピペットを使用して、プラナリア切片をゼラチンコーティングされたスライドに溶液C.スライドを室温で最大3日間暗所で乾燥させます。スライドを染色するには、スライドを染色および洗浄液に順次浸します。組織学的封入剤とカバースリップを使用してスライドを覆い、明視野顕微鏡で観察します。
1〜6ミリモルのピロカルピンで処理されたDugesia dorotocephalaを入手します。プラナリアを安楽死させた後、4%パラホルムアルデヒドに少なくとも24時間入れます。次に、プラナリアを20%スクロースに移し、溶液に1日間放置します。
PBSでそれぞれ5分間、3〜4回すすぎます。洗浄後、新鮮な20%ショ糖に移して、染色する準備ができるまで保管します。次に、プラナリアを特定の時間、適切な溶液に順番に置きます。
次に、粉ミルクでプラナリアを1時間ブロックし、一次抗体溶液中でチューブを摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、プラナリアをPBSで10分間すすぎます。ヤギ抗マウスIgG二次抗体をPBSで1ミリリットルあたり1μgに希釈し、プラナリアチューブを抗体溶液と室温で一晩インキュベートします。
洗浄後、プラナリア全体をスライドに取り付けます。ワームをカバースリップで覆います。水性封入剤で密封し、蛍光顕微鏡でスライドを観察します。
まず、ゴルジ体と免疫染色後のプラナリアの画像を取得します。オープンソースの画像解析ソフトウェアアプリケーションを起動し、アプリケーションにカラーdeconvolution2jarプラグインをインストールします。解析する画像を選択し、オープンソースの画像解析ソフトウェアアプリケーションにドラッグします。
[画像] タブに移動し、[色] をクリックして、[色 deconvolution2 バージョン 2.1] を選択します。ベクトルオプションでH DABをクリックし、出力オプションで8ビット伝送率をクリックします。シミュレートされた LUT が色 3 のクロス積、行列の表示、凡例の非表示がすべて選択されていることを確認し、[OK] をクリックします。
白黒画像を選択して、オープンソースの画像分析ソフトウェアアプリケーションが効果的に分析できることを確認します。次に、[画像]タブに移動します。[調整] をクリックし、しきい値を選択します。
DAB の染色または前景が白い背景で読み取られるように、しきい値を調整します。「解析」をクリックしてから、「測定値の設定」をクリックします。面積、最小および最大グレー値、しきい値への制限、表示ラベル、中央値、および平均グレー値を選択し、[OK] をクリックします。
次に、[分析]、[メジャー] の順にクリックして結果を取得します。最後に、結果画像をクリックし、[ファイル]をクリックして[名前を付けて保存]を選択し、結果を保存します。振動とフリックは、対照と比較して、6ミリモルのピロカルピン処理プラナリアで増加しました。
3ミリモルのピロカルピンに曝露されたプラナリアは、対照群と比較して、井戸の中央で有意に長い時間を過ごしました。6ミリモルのピロカルピンで処理されたプラナリアは、対照群と3ミリモルの両群よりも周辺で多くの時間を過ごした。6ミリモルのピロカルピン治療は、対照と比較して神経構造の数を大幅に減少させました。
