Dünya Sağlık Örgütü, bu gezegendeki her dört kişiden birinin helmint olarak bilinen parazit solucanlarla enfekte olduğunu tahmin ediyor. Helmintlere karşı koruyucu bağışıklık tepkisinin nasıl başlatıldığını, düzenlendiğini ve yürütüldüğünü anlamayı amaçlıyoruz. Helmintler, memeli konakçıları içinde onlarca yıl, en azından güçlü bir bağışıklık tepkisi ile karşı karşıya kaldıklarında bile üreyecek kadar uzun süre hayatta kalırlar.
Şimdi bu parazitlerin, hayatta kalmalarını uzatmak için konakçılarının bağışıklık tepkisini nasıl manipüle ettiğini, kaçtığını ve bastırdığını anlamaya başlıyoruz. Strongyloides Ratti enfeksiyonunu inceleyen bir zorluk, bu parazitin ağırlıklı olarak dokudan baş ve bağırsağa özel göçüdür. Baş ve bağırsaktaki göç eden larvaları ölçerek, farklı bölgelerdeki farklı bağışıklık efektörlerini inceleyebiliriz.
Grubumuz, mast hücrelerinin ve bazal alanların doku göçü için tamamen vazgeçilebilir olduğunu, ancak S.ratti'nin bağırsaktan atılması için gerekli olduğunu tespit etti. Buna karşılık, nötr alanlar bağırsak bağışıklığında önemli bir rol oynamaz, ancak dokudaki göç eden larvaları öldürmek için gereklidir. S.ratti enfeksiyonundaki cinsiyet farklılıkları üzerine yaptığım çalışma sırasında, hem erkek hem de dişi farelerin dokularında benzer sayıda göç eden larva olduğunu gözlemledim.
Bununla birlikte, erkek farelerin bağırsağında dişi farelere kıyasla daha yüksek bir parazit sayısı buldum. Bu, bağırsak bağışıklığının biyolojik cinsiyetler arasında farklılık gösterdiğini göstermektedir. Başlamak için Baermann cihazını hazırlayın.
Bir kelepçe kullanarak, hortumun altını eğik bir açıyla kapatın ve elek suya batırana kadar cihazı ılık suyla doldurun. Elek içine bir mendil mendil yerleştirin ve dışkı kömürü karışımı ile doldurun. Ardından, doğrudan Baermann cihazının arkasına yerleştirilmiş ışığı açın ve canlı iL3'ün silme işleminden aktif olarak geçmesine izin verin.
30 dakika sonra, çökelmiş larvaları 50 mililitrelik bir tüpe toplamak için kelepçeyi kısaca açın ve hacmi mümkün olduğunca en aza indirin. Ardından, 50 mililitrelik tüpü% 1 penisilin streptomisin içeren PBS ile doldurun. Süpernatanı çıkarmadan önce larvaların 30 dakika boyunca dört santigrat derecede yerçekimi ile tüpün dibine yerleşmesine izin verin.
Üçüncü yıkamadan sonra, pelet boyutuna bağlı olarak peleti 30-50 mililitre PBS penisilin streptomisin içinde tekrar süspanse edin. Pipetlemeden hemen önce, iL3 larvaları hızlı bir şekilde çöktüğünde çözeltiyi çalkalayın ve çözeltinin bir mikrolitrelik damlasını bir mikroskopi slaytına aktarın. Damlacıkları ters çevrilmiş bir mikroskop altında 40 kat büyütmede inceleyin.
iL3 larvalarının canlı bir şekilde hareket ettiğinden emin olun. Başlamak için, Baermann aparatını kullanarak% 1 penisilin streptomisin içeren PBS'de 1000 veya 2000 iL3 larvaları hazırlayın. iL3 larvaları yerçekimi ile yerleştikten sonra, süpernatanı mümkün olduğunca tamamen aspire etmek için 0,5 mililitrelik bir şırınga kullanın ve tüpte yaklaşık 30 mikrolitre bırakın.
Tüpü hafifçe vurarak veya 0,5 mililitrelik bir şırınga kullanarak iL3 süspansiyonunu yeniden askıya alın ve kalan süspansiyonu şırıngaya aspire edin. Şimdi fareyi tırnağından tutun ve bir arka ayağınızı sabitleyin. Deri altında, iL3 larvalarını içeren tüm çözeltiyi düz bir açıyla ayak pedine enjekte edin ve ardından şırıngayı yavaşça geri çekin.
Ötenazi yapılmış, enfekte farenin karnına ve boynuna ticari bir dezenfektan püskürtün. Makas kullanarak, cildi karnın üzerinden kesin ve karın ön duvarını ortaya çıkarmak için geri çekin. Periton boşluğunu açtıktan sonra, diyaframı kesin ve plevral boşluktaki akciğerleri ortaya çıkarmak için kaburgaları her iki tarafa açın.
Daha sonra, akciğer loblarını, yaklaşık dört milimetrede çizilen veya yazdırılan çizgilerle işaretlenmiş ve kuyu başına bir mililitre musluk suyu ile doldurulmuş 24 oyuklu bir plakaya toplayın. Şimdi, tüm akciğeri her biri yaklaşık 0,75 santimetre x 0,75 santimetre olan altı parçaya bölün. Farenin kafasını kestikten sonra, kas dokusunun çıkarılmasını en aza indirerek parmaklarınızı kullanarak cildi ve kürkü çıkarın.
Gözlerin arkasından ve başın ortasından uzunlamasına keserek kafanın tamamını dörde bölün. Ön ve arka kadranları iki mililitre musluk suyu içeren altı oyuklu bir plakaya yerleştirin. İnkübasyondan sonra, plakaları son bir kez döndürün, ardından kalan doku parçalarını forseps kullanarak kuyucuklardan çıkarın ve atın.
Kuyucuklardaki tüm larvaları 40 kez ters çevrilmiş mikroskop altında sayın. Tam bir sayım sağlamak için kuyu diplerindeki çizgileri takip edin. Karın bölgesini ticari bir dezenfektana batırdıktan sonra, karın üzerindeki cildi makasla kesin ve karın ön duvarını ortaya çıkarmak için geri çekin.
Periton boşluğunu açmak için orta hat kesisi yapın. Makas kullanarak, tüm bağırsağı ayırmak için mide ile proksimal duodenum arasında ve ayrıca kolon ile anüs arasında kesin. Ardından, parmaklarınızı kullanarak bağırsağı nazikçe dışarı çekin ve musluk suyu içeren bir Petri kabına yerleştirin.
Bağırsak bölümlerini uzunlamasına kesin ve dışkı ve mukusu temizlemek için en az 10 saniye musluk suyunda kuvvetlice çalkalayın. Temizlenmiş bağırsak bölümlerini 20 mililitre musluk suyu içeren 50 mililitrelik tüplere aktarın ve inkübe edin. Üç saatlik inkübasyondan sonra, bağırsak dokusunu sudan çıkarın.
Tüpleri oda sıcaklığında dikey olarak yerleştirin ve parazitlerin 30 dakika boyunca yerçekimi ile çökelmesine izin verin. Tüpte yaklaşık beş mililitre su kalana kadar süpernatanı aspire edin. Tüpü musluk suyuyla toplam 25 mililitre hacme kadar doldurun.
Süspansiyonun görünürlüğü net olduğunda, süpernatanı yaklaşık beş mililitre su kalana kadar aspire edin. Bu sıvıyı, çizgilerle işaretlenmiş altı oyuklu bir plakada fare bağırsağı başına iki oyuğa aktarın. Kuyu diplerine çizilen çizgiler boyunca hareket ederek 40 kat büyütme ile ters çevrilmiş bir mikroskop altında yetişkin dişi parazitleri sayın.
Larvalar ilk olarak enfeksiyondan sonraki bir gün kafada tespit edildi ve tek tip dağılım gösterdi ve küçük bir kısmı da akciğerlerden alındı. Kafadaki larva sayısı, enfeksiyondan sonraki ikinci günde önemli ölçüde artmış, kafada ortalama 174 larva ve akciğerlerde 17 larva olmuştur. Kafadaki larva sayıları, enfeksiyondan sonraki üçüncü günde belirgin bir şekilde azaldı ve dördüncü güne kadar kafadan larva alınmadı.
Enfeksiyondan sonraki dördüncü günden itibaren bağırsakta parazitler tespit edildi, çoğunluğu duodenumda lokalize oldu ve jejunumun ilk üçte ikisi altıncı güne kadar devam etti. Enfeksiyondan sonraki yedinci günde, çoğu yetişkin parazit çekumda lokalize oldu ve burada sayıları 11. güne kadar önemli ölçüde azalmaya başlamadan önce dokuzuncu güne kadar devam ettiler. Enfeksiyondan sonraki 14. günde bağırsaktan hiçbir parazitik yetişkin alınmadı ve toplam bağırsak parazit sayıları bu zamana kadar sıfıra düştü.
Başlamak için, Strongyloides ratti ile enfekte olmuş fareleri, enfeksiyondan sonraki beşinci ve 12. günlerde birkaç kat selüloz ve minimum çöp içeren kafeslerde tutun. Enfeksiyondan sonraki 6 ila 8 ve 13 ila 15. günlerde, fareleri taze kafeslere aktarın ve tüm dışkı peletlerini eski kafeslerden toplayın. Toplanan dışkıyı bir kafesten 50 mililitrelik tek bir tüpe koyun.
Önceden ıslatılmış aktif kömürü alın ve kullanmadan önce yıkayın. Dışkıyı önceden ıslatılmış aktif kömürle eşit miktarlarda karıştırın. Karışımı bir gradyan oluşturacak şekilde çapraz olarak düzenleyin ve 1'e 2'lik bir nihai orana ulaşmak için ek bir aktif kömür tabakası ile kaplayın.
Ardından, cam kabı şeffaf bir filmle örtün ve uygun hava sirkülasyonu sağlamak için hava deliklerinin açıldığından emin olun.
