تقدر منظمة الصحة العالمية أن واحدا من كل أربعة أشخاص على هذا الكوكب مصاب بالديدان الطفيلية المعروفة باسم الديدان الطفيلية. نهدف إلى فهم كيفية بدء الاستجابة المناعية الوقائية ضد الديدان الطفيلية وتنظيمها وتنفيذها. تعيش الديدان الطفيلية داخل مضيفات الثدييات لعقود، على الأقل لفترة كافية للتكاثر، حتى عندما تواجه استجابة مناعية قوية.
لقد بدأنا الآن نفهم كيف تتلاعب هذه الطفيليات بالاستجابة المناعية لمضيفها وتتهرب منها وتقمعها لإطالة بقائها على قيد الحياة. يتمثل التحدي الذي تقضيه دراسة عدوى Strongyloides Ratti في الهجرة الخاصة لهذا الطفيلي ، والذي يحدث في الغالب عبر الأنسجة إلى الرأس والأمعاء. من خلال تحديد اليرقات المهاجرة في الرأس والأمعاء ، يمكننا تشريح مؤثرات المناعة المختلفة في مواقع مختلفة.
أثبتت مجموعتنا أن الخلايا البدينة والحقول القاعدية يمكن الاستغناء عنها تماما لهجرة الأنسجة ، ولكنها ضرورية لطرد S.ratti من الأمعاء. على النقيض من ذلك ، لا تلعب الحقول المحايدة دورا مهما في مناعة الأمعاء ، ولكنها ضرورية في قتل اليرقات المهاجرة في الأنسجة. خلال دراستي للفروق بين الجنسين في عدوى S.ratti ، لاحظت أن كلا من الفئران من الذكور والإناث لديهم أعداد متشابهة من اليرقات المهاجرة في أنسجتها.
ومع ذلك ، وجدت عددا أعلى من الطفيليات في أمعاء ذكور الفئران مقارنة بإناث الفئران. يشير هذا إلى أن المناعة المعوية تختلف بين الجنسين البيولوجيين. للبدء ، قم بإعداد جهاز Baermann.
باستخدام المشبك ، أغلق الجزء السفلي من الخرطوم بزاوية مائلة واملأ الجهاز بالماء الفاتر حتى يتم غمر المنخل. ضع منديلا في المنخل واملأه بخليط فحم البراز. بعد ذلك ، قم بتشغيل الضوء الموجود خلف جهاز Baermann مباشرة واسمح ل iL3 القابل للتطبيق بالترحيل بنشاط عبر المسح.
بعد 30 دقيقة ، افتح المشبك لفترة وجيزة لجمع اليرقات المستقرة في أنبوب سعة 50 مليلتر ، مع تقليل الحجم قدر الإمكان. ثم املأ الأنبوب سعة 50 مليلتر ب PBS الذي يحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين. دع اليرقات تستقر في قاع الأنبوب عن طريق الجاذبية عند أربع درجات مئوية لمدة 30 دقيقة قبل إزالة المادة الطافية.
بعد الغسيل الثالث ، أعد تعليق الحبيبات في 30-50 مل من PBS البنسلين ستربتومايسين اعتمادا على حجم الحبيبات. قبل سحب العينة مباشرة، حرك المحلول حيث تستقر يرقات iL3 بسرعة وتنقل قطرة ميكرولتر واحدة من المحلول إلى شريحة الفحص المجهري. افحص القطرات تحت المجهر المقلوب بتكبير 40 مرة.
تأكد من أن يرقات iL3 تتحرك بوضوح. للبدء ، قم بإعداد 1000 أو 2000 يرقة iL3 في PBS تحتوي على 1٪ بنسلين ستربتومايسين باستخدام جهاز Baermann. بمجرد أن تستقر يرقات iL3 بالجاذبية ، استخدم حقنة 0.5 مل لشفط المادة الطافية بشكل كامل قدر الإمكان ، مع ترك ما يقرب من 30 ميكرولترا في الأنبوب.
أعد تعليق التعليق iL3 عن طريق النقر على الأنبوب أو استخدام حقنة سعة 0.5 ملليلتر واستنشاق التعليق المتبقي في المحقنة. الآن التقط الماوس من القفص وقم بتأمين قدم خلفية واحدة. تحت الجلد ، قم بحقن المحلول بالكامل الذي يحتوي على يرقات iL3 في وسادة القدم بزاوية مسطحة ثم اسحب المحقنة ببطء.
رش بطن وعنق الفأر المصاب بالقتل الرحيم بمطهر تجاري. باستخدام المقص ، قم بقص الجلد فوق البطن واسحبه للخلف للكشف عن جدار البطن الأمامي. بعد فتح التجويف البريتوني ، قم بقطع الحجاب الحاجز وافتح الأضلاع على كلا الجانبين لفضح الرئتين في التجويف الجنبي.
بعد ذلك ، اجمع فصوص الرئة في صفيحة من 24 بئرا مميزة بخطوط مرسومة أو مطبوعة بحوالي أربعة ملليمترات ومليئة بملليلتر واحد من ماء الصنبور لكل بئر. الآن ، قم بتقطيع الرئة بأكملها إلى ست قطع ، كل منها حوالي 0.75 سم × 0.75 سم. بعد قطع رأس الفأر ، قم بإزالة الجلد والفراء باستخدام الأصابع ، مما يقلل من إزالة الأنسجة العضلية.
قم بتشريح الرأس بالكامل إلى أربعة أرباع عن طريق القطع خلف العينين وطوليا عبر مركز الرأس. ضع الأرباع الأمامية والخلفية في صفيحة من ستة آبار تحتوي على ملليلترين من ماء الصنبور. بعد الحضانة ، قم بتدوير الألواح مرة أخيرة ، ثم قم بإزالة أجزاء الأنسجة المتبقية من الآبار باستخدام الملقط وتخلص منها.
عد جميع اليرقات في الآبار تحت مجهر مقلوب 40 مرة. اتبع الخطوط الموجودة على قيعان الآبار لضمان العد الكامل. بعد نقع منطقة البطن في مطهر تجاري ، قم بقص الجلد فوق البطن بالمقص واسحبه للخلف لكشف جدار البطن الأمامي.
قم بعمل شق خط الوسط لفتح التجويف البريتوني. باستخدام المقص ، اقطع بين المعدة والاثني عشر القريب وكذلك بين القولون وفتحة الشرج لفصل الأمعاء بأكملها. ثم ، باستخدام الأصابع ، اسحب الأمعاء برفق وضعها في طبق بتري يحتوي على ماء الصنبور.
اقطع أقسام الأمعاء مفتوحة طوليا ورجها بقوة في ماء الصنبور لمدة 10 ثوان على الأقل لغسل البراز والمخاط. انقل الأقسام المعوية التي تم تنظيفها إلى أنابيب سعة 50 مليلتر تحتوي على 20 مل من ماء الصنبور واحتضنها. بعد ثلاث ساعات من الحضانة ، قم بإزالة الأنسجة المعوية من الماء.
ضع الأنابيب عموديا في درجة حرارة الغرفة واترك الطفيليات تترسب عن طريق الجاذبية لمدة 30 دقيقة. استنشق المادة الطافية حتى يبقى ما يقرب من خمسة ملليلتر من الماء في الأنبوب. أعد ملء الأنبوب بماء الصنبور إلى حجم إجمالي يبلغ 25 ملليلترا.
عندما تكون رؤية التعليق واضحة ، استنشق المادة الطافية حتى يتبقى حوالي خمسة ملليلتر من الماء. انقل هذا السائل إلى بئرين لكل أمعاء فأر في صفيحة من ستة آبار مميزة بخطوط. عد الطفيليات الأنثوية البالغة تحت مجهر مقلوب بتكبير 40 مرة عن طريق التحرك على طول الخطوط المرسومة على قيعان الآبار.
تم اكتشاف اليرقات لأول مرة في الرأس في اليوم الأول بعد الإصابة ، حيث أظهرت توزيعا موحدا ، مع استرداد جزء صغير أيضا من الرئتين. زاد عدد اليرقات في الرأس بشكل ملحوظ في اليوم الثاني بعد الإصابة ، بمتوسط 174 يرقة في الرأس و 17 يرقة في الرئتين. انخفضت أعداد اليرقات في الرأس بشكل ملحوظ بحلول اليوم الثالث بعد الإصابة ، مع عدم استرداد اليرقات من الرأس بحلول اليوم الرابع.
تم اكتشاف طفيليات في الأمعاء من اليوم الرابع بعد الإصابة ، مع معظمها في الاثني عشر واستمر الثلثان الأول من الصائم حتى اليوم السادس. بحلول اليوم السابع بعد الإصابة ، كانت معظم الطفيليات البالغة موضعية في الأعور ، حيث استمرت حتى اليوم التاسع ، قبل أن تبدأ أعدادها في الانخفاض بشكل كبير بحلول اليوم الحادي عشر. لم يتم استرداد أي بالغين طفيليين من الأمعاء في اليوم 14 بعد الإصابة ، وانخفض إجمالي أعداد الطفيليات المعوية إلى الصفر بحلول هذه المرحلة الزمنية.
للبدء ، احتجاز الفئران المصابة ب Strongyloides ratti في أقفاص بها عدة طبقات من السليلوز والحد الأدنى من القمامة في اليومين الخامس و 12 بعد الإصابة. في الأيام من 6 إلى 8 و 13 إلى 15 بعد الإصابة ، انقل الفئران إلى أقفاص جديدة واجمع كل حبيبات البراز من الأقفاص القديمة. اجمع البراز الذي تم جمعه من قفص واحد في أنبوب واحد سعة 50 مل.
خذ الفحم المنشط المنقوع مسبقا واغسله قبل الاستخدام. امزج البراز مع الفحم المنشط المنقوع مسبقا بكميات متساوية. رتبي الخليط قطريا لتشكيل تدرج وقم بتغطيته بطبقة إضافية من الفحم المنشط للوصول إلى النسبة النهائية من 1 إلى 2.
بعد ذلك ، قم بتغطية الدورق الزجاجي بغشاء شفاف ، مع التأكد من عمل فتحات هوائية للسماح بتدوير الهواء بشكل مناسب.
