A Organização Mundial da Saúde estima que uma em cada quatro pessoas neste planeta está infectada com vermes parasitas conhecidos como helmintos. Nosso objetivo é entender como a resposta imune protetora contra helmintos é iniciada, regulada e executada. Os helmintos sobrevivem dentro dos hospedeiros mamíferos por décadas, pelo menos o tempo suficiente para se reproduzir, mesmo quando confrontados com uma forte resposta imunológica.
Estamos começando a entender agora como esses parasitas manipulam, evadem e suprimem a resposta imune de seu hospedeiro para prolongar sua sobrevivência. Um desafio ao estudar a infecção por Strongyloides Ratti é a migração especial desse parasita, que é predominantemente através do tecido para a cabeça e intestino. Ao quantificar as larvas migratórias na cabeça e no intestino, podemos dissecar diferentes efetores imunológicos em diferentes locais.
Nosso grupo estabeleceu que os mastócitos e os campos basais são completamente dispensáveis para a migração tecidual, mas são essenciais para a ejeção de S. ratti do intestino. Por outro lado, os campos neutros não desempenham um papel importante na imunidade intestinal, mas são essenciais para matar as larvas migratórias no tecido. Durante meu estudo das diferenças sexuais na infecção por S. ratti, observei que camundongos machos e fêmeas tinham números semelhantes de larvas migratórias em seus tecidos.
No entanto, encontrei um número maior de parasitas no intestino de camundongos machos em comparação com camundongos fêmeas. Isso sugere que a imunidade intestinal varia entre os sexos biológicos. Para começar, prepare o aparelho de Baermann.
Usando uma braçadeira, feche a parte inferior da mangueira em um ângulo oblíquo e encha o aparelho com água morna até que a peneira esteja submersa. Coloque um lenço de papel na peneira e encha-o com a mistura de carvão para fezes. Em seguida, acenda a luz posicionada diretamente atrás do aparelho de Baermann e permita que o iL3 viável migre ativamente através do lenço.
Após 30 minutos, abra brevemente a pinça para coletar as larvas sedimentadas em um tubo de 50 mililitros, minimizando o volume o máximo possível. Em seguida, encha o tubo de 50 mililitros com PBS contendo 1% de penicilina estreptomicina. Deixe as larvas assentarem no fundo do tubo por gravidade a quatro graus Celsius por 30 minutos antes de remover o sobrenadante.
Após a terceira lavagem, ressuspenda o pellet em 30-50 mililitros de penicilina estreptomicina PBS, dependendo do tamanho do pellet. Imediatamente antes da pipetagem, agite a solução à medida que as larvas de iL3 se assentam rapidamente e transfira uma gota de microlitro da solução para uma lâmina de microscopia. Inspecione as gotículas sob um microscópio invertido com ampliação de 40 vezes.
Certifique-se de que as larvas de iL3 estejam se movendo vividamente. Para começar, prepare 1000 ou 2000 larvas de iL3 em PBS contendo 1% de penicilina estreptomicina usando o aparelho de Baermann. Assim que as larvas de iL3 se assentarem por gravidade, use uma seringa de 0,5 mililitros para aspirar o sobrenadante o mais completamente possível, deixando aproximadamente 30 microlitros no tubo.
Ressuspenda a suspensão iL3 sacudindo o tubo ou usando uma seringa de 0,5 mililitro e aspire a suspensão restante para a seringa. Agora pegue o mouse pela nuca e prenda uma pata traseira. Por via subcutânea, injete toda a solução contendo as larvas de iL3 na almofada do pé em um ângulo plano e, em seguida, retraia lentamente a seringa.
Pulverize o abdômen e o pescoço do camundongo infectado e eutanasiado com um desinfetante comercial. Usando uma tesoura, corte a pele sobre o abdômen e puxe-a para trás para revelar a parede abdominal anterior. Depois de abrir a cavidade peritoneal, corte o diafragma e abra as costelas para ambos os lados para expor os pulmões na cavidade pleural.
Em seguida, colete os lóbulos pulmonares em uma placa de 24 poços marcada com linhas desenhadas ou impressas em aproximadamente quatro milímetros e preenchida com um mililitro de água da torneira por poço. Agora, corte todo o pulmão em seis pedaços, cada um com aproximadamente 0,75 centímetros por 0,75 centímetros. Depois de cortar a cabeça do rato, remova a pele e o pelo com os dedos, minimizando a remoção do tecido muscular.
Disseque a cabeça completa em quatro quartos, cortando atrás dos olhos e longitudinalmente pelo centro da cabeça. Coloque os quadrantes anterior e posterior em uma placa de seis poços contendo dois mililitros de água da torneira. Após a incubação, gire as placas uma última vez, remova as partes de tecido restantes dos poços usando uma pinça e descarte-as.
Conte todas as larvas nos poços sob um microscópio invertido 40 vezes. Siga as linhas no fundo do poço para garantir uma contagem completa. Depois de molhar a região abdominal em um desinfetante comercial, corte a pele sobre o abdômen com uma tesoura e puxe-a para trás para expor a parede abdominal anterior.
Faça uma incisão na linha média para abrir a cavidade peritoneal. Usando uma tesoura, corte entre o estômago e o duodeno proximal, bem como entre o cólon e o ânus para separar todo o intestino. Em seguida, usando os dedos, retire suavemente o intestino e coloque-o em uma placa de Petri contendo água da torneira.
Corte as seções intestinais abertas longitudinalmente e agite-as vigorosamente em água da torneira por pelo menos 10 segundos para lavar as fezes e o muco. Transfira as seções intestinais limpas para tubos de 50 mililitros contendo 20 mililitros de água da torneira e incuba. Após três horas de incubação, remova o tecido intestinal da água.
Coloque os tubos verticalmente à temperatura ambiente e deixe os parasitas sedimentarem por gravidade por 30 minutos. Aspirar o sobrenadante até que restem cerca de cinco mililitros de água no tubo. Reabasteça o tubo com água da torneira até um volume total de 25 mililitros.
Quando a visibilidade da suspensão estiver desobstruída, aspirar o sobrenadante até restarem cerca de cinco mililitros de água. Transfira este líquido para dois poços por intestino de camundongo em uma placa de seis poços marcada com linhas. Conte os parasitas fêmeas adultas sob um microscópio invertido com uma ampliação de 40 vezes, movendo-se ao longo das linhas desenhadas no fundo do poço.
As larvas foram detectadas pela primeira vez na cabeça no primeiro dia após a infecção, mostrando distribuição uniforme, com uma pequena fração também recuperada dos pulmões. O número de larvas na cabeça aumentou significativamente no segundo dia pós-infecção, com uma média de 174 larvas na cabeça e 17 larvas nos pulmões. O número de larvas na cabeça diminuiu acentuadamente no terceiro dia após a infecção, sem larvas recuperadas da cabeça no quarto dia.
Os parasitas foram detectados no intestino desde o quarto dia pós-infecção, com a maioria localizada no duodeno e os primeiros dois terços do jejuno persistindo até o sexto dia. No sétimo dia após a infecção, a maioria dos parasitas adultos estava localizada no ceco, onde persistiram até o nono dia, antes que seus números começassem a diminuir significativamente no dia 11. Nenhum adulto parasita foi recuperado do intestino no dia 14 após a infecção, e o número total de parasitas intestinais caiu para zero nesse momento.
Para começar, mantenha os ratos infectados com Strongyloides ratti em gaiolas com várias camadas de celulose e cama mínima nos dias cinco e 12 após a infecção. Nos dias 6 a 8 e 13 a 15 após a infecção, transfira os ratos para gaiolas frescas e colete todos os pellets fecais das gaiolas antigas. Agrupe as fezes coletadas de uma gaiola em um único tubo de 50 mililitros.
Pegue o carvão ativado pré-embebido e lave-o antes de usar. Misture as fezes com carvão ativado pré-embebido em quantidades iguais. Disponha a mistura na diagonal para formar um gradiente e cubra-a com uma camada adicional de carvão ativado para atingir uma proporção final de 1 para 2.
Em seguida, cubra o copo de vidro com uma película transparente, certificando-se de que os orifícios de ar sejam feitos para permitir a circulação adequada do ar.
