По оценкам Всемирной организации здравоохранения, каждый четвертый человек на этой планете заражен паразитическими червями, известными как гельминты. Мы стремимся понять, как инициируется, регулируется и реализуется защитный иммунный ответ против гельминтов. Гельминты выживают в организме млекопитающих в течение десятилетий, по крайней мере, достаточно долго, чтобы размножаться, даже столкнувшись с сильным иммунным ответом.
Теперь мы начинаем понимать, как эти паразиты манипулируют, уклоняются и подавляют иммунный ответ своего хозяина, чтобы продлить свою выживаемость. Проблемой при изучении инфекции Strongyloides Ratti является особая миграция этого паразита, которая преимущественно через ткани поступает в голову и кишечник. Количественно оценивая мигрирующие личинки в голове и кишечнике, мы можем препарировать различные иммунные эффекторы в разных местах.
Наша группа установила, что тучные клетки и базальные поля полностью необходимы для миграции тканей, но необходимы для выведения S.ratti из кишечника. Напротив, нейтральные поля не играют важной роли в кишечном иммунитете, но необходимы для уничтожения мигрирующих личинок в тканях. Во время изучения половых различий при инфекции S.ratti я заметил, что как самцы, так и самки мышей имели одинаковое количество мигрирующих личинок в своих тканях.
Тем не менее, я обнаружил более высокое количество паразитов в кишечнике самцов мышей по сравнению с самками мышей. Это говорит о том, что кишечный иммунитет варьируется между биологическими полами. Для начала подготовьте аппарат Бермана.
С помощью хомута закройте дно шланга под косым углом и наполните аппарат теплой водой до тех пор, пока сито не будет погружено в воду. Поместите салфетку в сито и заполните его смесью каловых углей. Затем включите свет, расположенный непосредственно за аппаратом Бермана, и позвольте жизнеспособному iL3 активно мигрировать через стеклоочиститель.
Через 30 минут ненадолго откройте зажим, чтобы собрать осевшие личинки в 50 миллилитровую трубку, максимально минимизировав объем. Затем заполните 50-миллилитровую пробирку PBS, содержащей 1% пенициллина стрептомицина. Дайте личинкам осесть на дне пробирки под действием силы тяжести при температуре четыре градуса Цельсия в течение 30 минут, прежде чем удалить надосадочную жидкость.
После третьей промывки повторно суспендируйте гранулу в 30-50 миллилитрах PBS пенициллина стрептомицина в зависимости от размера гранул. Непосредственно перед пипетированием перемешайте раствор по мере того, как личинки iL3 быстро осядут, и перенесите одну каплю микролитра раствора на предметное стекло для микроскопии. Осмотрите капли под инвертированным микроскопом при 40-кратном увеличении.
Убедитесь, что личинки iL3 активно двигаются. Для начала подготовьте 1000 или 2000 личинок iL3 в PBS, содержащих 1% пенициллина стрептомицина, с помощью аппарата Бермана. Как только личинки iL3 осядут под действием силы тяжести, используйте шприц объемом 0,5 миллилитра, чтобы как можно полнее аспирировать надосадочную жидкость, оставив в пробирке примерно 30 микролитров.
Повторно суспендируйте суспензию iL3, щелкнув трубкой или используя шприц объемом 0,5 миллилитра, и аспирируйте оставшуюся суспензию в шприц. Теперь возьмите мышь за загривок и закрепите одну заднюю ногу. Подкожно введите весь раствор, содержащий личинки iL3, в подушечку стопы под плоским углом, а затем медленно втяните шприц.
Опрыскайте живот и шею усыпленной, зараженной мыши коммерческим дезинфицирующим средством. С помощью ножниц разрежьте кожу над животом и оттяните ее назад, чтобы открыть переднюю брюшную стенку. После вскрытия брюшинной полости разрежьте диафрагму и раскройте ребра с обеих сторон, чтобы обнажить легкие в плевральной полости.
Затем соберите доли легких в 24-луночную пластину, отмеченную линиями, нарисованными или напечатанными примерно на четыре миллиметра и заполненную одним миллилитром водопроводной воды на лунку. Теперь разрежьте все легкое на шесть частей, каждая примерно 0,75 сантиметра на 0,75 сантиметра. После срезания головы мышки удалите кожу и шерсть с помощью пальцев, минимизировав удаление мышечной ткани.
Разрежьте всю голову на четыре четверти, разрезав за глазами и в продольном направлении через центр головы. Поместите передний и задний квадранты в шестилуночную пластину, содержащую два миллилитра водопроводной воды. После инкубации прокрутите пластины в последний раз, затем удалите оставшиеся части ткани из лунок с помощью щипцов и выбросьте их.
Посчитайте всех личинок в лунках под 40-кратным инвертированным микроскопом. Следуйте линиям на дне скважины, чтобы обеспечить полный подсчет. Замочив область живота в коммерческом дезинфицирующем средстве, разрежьте кожу над животом ножницами и оттяните ее назад, чтобы обнажить переднюю брюшную стенку.
Сделайте разрез по средней линии, чтобы открыть брюшную полость. С помощью ножниц разрежьте между желудком и проксимальным отделом двенадцатиперстной кишки, а также между толстой кишкой и анусом, чтобы отделить весь кишечник. Затем пальцами аккуратно вытащите кишечник и поместите его в чашку Петри с водой из-под крана.
Разрежьте срезы кишечника, раскройте в продольном направлении и энергично встряхните их в водопроводной воде не менее 10 секунд, чтобы вымыть кал и слизь. Переложите очищенные срезы кишечника в 50-миллилитровые пробирки, содержащие 20 миллилитров водопроводной воды, и инкубируйте. После трех часов инкубации удалите ткани кишечника из воды.
Поместите трубки вертикально при комнатной температуре и дайте паразитам оседать под действием силы тяжести в течение 30 минут. Отсасывайте надосадочную жидкость до тех пор, пока в трубке не останется примерно пять миллилитров воды. Наполните трубку водой из-под крана до общего объема 25 миллилитров.
Когда видимость суспензии станет ясной, аспирируйте надосадочную жидкость до тех пор, пока не останется примерно пять миллилитров воды. Перелейте эту жидкость в две лунки на кишечник мыши в шестилуночной пластине, отмеченной линиями. Подсчитайте взрослых самок паразитов под перевернутым микроскопом с 40-кратным увеличением, двигаясь по линиям, проведенным на дне лунки.
Личинки были впервые обнаружены в голове в первый день после заражения, демонстрируя равномерное распределение, при этом небольшая часть также была извлечена из легких. Количество личинок в голове значительно увеличилось на второй день после заражения, в среднем 174 личинки в голове и 17 личинок в легких. Количество личинок в голове заметно уменьшилось к третьему дню после заражения, а к четвертому дню из головы не было извлечено личинок.
Паразиты были обнаружены в кишечнике с четвертого дня после заражения, причем большинство из них локализовались в двенадцатиперстной кишке, а первые две трети тощей кишки сохранялись до шестого дня. К седьмому дню после заражения большинство взрослых паразитов были локализованы в слепой кишке, где они сохранялись до девятого дня, прежде чем их численность начала значительно снижаться к 11-му дню. На 14-й день после заражения из кишечника не было извлечено ни одного паразитарного взрослого человека, и к этому моменту общее количество кишечных паразитов упало до нуля.
Для начала держите крыс, инфицированных Strongyloides ratti, в клетках с несколькими слоями целлюлозы и минимальным количеством подстилки на пятый и 12-й дни после заражения. На 6-8 и 13-15 день после заражения переведите крыс в свежие клетки и соберите все фекальные гранулы из старых клеток. Соберите собранные фекалии из одной клетки в одну 50-миллилитровую пробирку.
Возьмите предварительно замоченный активированный уголь и промойте его перед использованием. Смешайте каловые массы с предварительно замоченным активированным углем в равных количествах. Расположите смесь по диагонали, чтобы образовался градиент, и покройте ее дополнительным слоем активированного угля, чтобы достичь конечного соотношения 1 к 2.
Затем накройте стеклянный стакан прозрачной пленкой, следя за тем, чтобы в нем были сделаны отверстия для правильной циркуляции воздуха.
