L’Organisation mondiale de la santé estime qu’une personne sur quatre sur cette planète est infectée par des vers parasites connus sous le nom d’helminthes. Notre objectif est de comprendre comment la réponse immunitaire protectrice contre les helminthes est initiée, régulée et exécutée. Les helminthes survivent au sein des mammifères hôtes pendant des décennies, au moins assez longtemps pour se reproduire, même lorsqu’ils sont confrontés à une forte réponse immunitaire.
Nous commençons maintenant à comprendre comment ces parasites manipulent, échappent et suppriment la réponse immunitaire de leur hôte pour prolonger leur survie. L’un des défis de l’étude de l’infection à Strongyloides Ratti est la migration spéciale de ce parasite, qui se fait principalement à travers les tissus vers la tête et l’intestin. En quantifiant les larves migratrices dans la tête et l’intestin, nous pouvons disséquer différents effecteurs immunitaires à différents endroits.
Notre groupe a établi que les mastocytes et les champs basaux sont totalement dispensables pour la migration des tissus, mais sont essentiels à l’éjection de S. ratti de l’intestin. En revanche, les champs neutres ne jouent pas un rôle important dans l’immunité intestinale, mais sont essentiels pour tuer les larves migratrices dans les tissus. Au cours de mon étude des différences sexuelles dans l’infection à S. ratti, j’ai observé que les souris mâles et femelles avaient un nombre similaire de larves migratrices dans leurs tissus.
Cependant, j’ai trouvé un nombre de parasites plus élevé dans l’intestin des souris mâles par rapport aux souris femelles. Cela suggère que l’immunité intestinale varie entre les sexes biologiques. Pour commencer, préparez l’appareil Baermann.
À l’aide d’une pince, fermez le bas du tuyau à un angle oblique et remplissez l’appareil d’eau tiède jusqu’à ce que le tamis soit immergé. Placez une lingette en papier dans le tamis et remplissez-le avec le mélange de charbon de bois fécal. Ensuite, allumez la lumière positionnée directement derrière l’appareil de Baermann et laissez l’iL3 viable migrer activement à travers le lingette.
Après 30 minutes, ouvrez brièvement la pince pour recueillir les larves déposées dans un tube de 50 millilitres, en minimisant le volume autant que possible. Ensuite, remplissez le tube de 50 millilitres avec du PBS contenant 1 % de pénicilline streptomycine. Laissez les larves se déposer au fond du tube par gravité à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes avant d’éliminer le surnageant.
Après le troisième lavage, remettez en suspension la pastille dans 30 à 50 millilitres de pénicilline PBS streptomycine selon la taille de la pastille. Immédiatement avant le pipetage, agitez la solution pendant que les larves d’iL3 se déposent rapidement et transférez une goutte d’un microlitre de la solution sur une lame de microscopie. Inspectez les gouttelettes sous un microscope inversé à un grossissement de 40 fois.
Assurez-vous que les larves d’iL3 se déplacent vivement. Pour commencer, préparez 1000 ou 2000 larves d’iL3 dans du PBS contenant 1 % de pénicilline streptomycine à l’aide de l’appareil de Baermann. Une fois que les larves d’iL3 se sont installées par gravité, utilisez une seringue de 0,5 millilitre pour aspirer le surnageant aussi complètement que possible, en laissant environ 30 microlitres dans le tube.
Remettez la suspension iL3 en agitant le tube ou à l’aide d’une seringue de 0,5 millilitre et aspirez la suspension restante dans la seringue. Maintenant, prenez la souris par la peau et fixez une patte arrière. Par voie sous-cutanée, injectez toute la solution contenant les larves d’iL3 dans le coussinet plantaire à plat, puis rétractez lentement la seringue.
Vaporisez l’abdomen et le cou de la souris euthanasiée et infectée avec un désinfectant commercial. À l’aide de ciseaux, coupez la peau de l’abdomen et tirez-la vers l’arrière pour révéler la paroi abdominale antérieure. Après avoir ouvert la cavité péritonéale, coupez le diaphragme et ouvrez les côtes des deux côtés pour exposer les poumons dans la cavité pleurale.
Ensuite, collectez les lobes pulmonaires dans une plaque de 24 puits marquée de lignes dessinées ou imprimées à environ quatre millimètres et remplie d’un millilitre d’eau du robinet par puits. Maintenant, coupez tout le poumon en six morceaux, chacun d’environ 0,75 centimètre sur 0,75 centimètre. Après avoir coupé la tête de la souris, retirez la peau et la fourrure à l’aide des doigts, en minimisant l’élimination du tissu musculaire.
Disséquez la tête entière en quatre quartiers en coupant derrière les yeux et longitudinalement à travers le centre de la tête. Placez les quadrants antérieur et postérieur dans une plaque à six puits contenant deux millilitres d’eau du robinet. Après l’incubation, faites tourner les plaques une dernière fois, puis retirez les parties de tissu restantes des puits à l’aide d’une pince et jetez-les.
Comptez toutes les larves dans les puits à l’aide d’un microscope inversé 40 fois. Suivez les lignes au fond des puits pour assurer un dénombrement complet. Après avoir trempé la région abdominale dans un désinfectant commercial, coupez la peau de l’abdomen avec des ciseaux et tirez-la vers l’arrière pour exposer la paroi abdominale antérieure.
Faites une incision médiane pour ouvrir la cavité péritonéale. À l’aide de ciseaux, coupez entre l’estomac et le duodénum proximal ainsi qu’entre le côlon et l’anus pour détacher tout l’intestin. Ensuite, à l’aide des doigts, retirez doucement l’intestin et placez-le dans une boîte de Pétri contenant de l’eau du robinet.
Ouvrez les sections de l’intestin dans le sens longitudinal et secouez-les vigoureusement dans l’eau du robinet pendant au moins 10 secondes pour éliminer les matières fécales et le mucus. Transférez les sections intestinales nettoyées dans des tubes de 50 millilitres contenant 20 millilitres d’eau du robinet et incuber. Après trois heures d’incubation, retirez le tissu intestinal de l’eau.
Placez les tubes verticalement à température ambiante et laissez les parasites sédimenter par gravité pendant 30 minutes. Aspirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste environ cinq millilitres d’eau dans le tube. Remplissez le tube avec de l’eau du robinet jusqu’à un volume total de 25 millilitres.
Lorsque la visibilité de la suspension est bonne, aspirez le surnageant jusqu’à ce qu’il reste environ cinq millilitres d’eau. Transférez ce liquide dans deux puits par intestin de souris dans une plaque à six puits marquée de lignes. Comptez les parasites femelles adultes au microscope inversé avec un grossissement de 40 fois en vous déplaçant le long des lignes tracées au fond des puits.
Les larves ont été détectées pour la première fois dans la tête le premier jour après l’infection, montrant une distribution uniforme, avec une petite fraction également récupérée dans les poumons. Le nombre de larves dans la tête a augmenté de manière significative le deuxième jour après l’infection, avec une moyenne de 174 larves dans la tête et 17 larves dans les poumons. Le nombre de larves dans la tête a diminué de façon marquée le troisième jour après l’infection, et aucune larve n’a été récupérée de la tête le quatrième jour.
Des parasites ont été détectés dans l’intestin dès le quatrième jour après l’infection, la majorité étant localisée dans le duodénum et les deux premiers tiers du jéjunum persistant jusqu’au sixième jour. Le septième jour après l’infection, la plupart des parasites adultes étaient localisés dans le caecum et ont persisté jusqu’au neuvième jour, avant que leur nombre ne commence à diminuer de manière significative au 11e jour. Aucun adulte parasite n’a été extrait de l’intestin le 14e jour après l’infection, et le nombre total de parasites intestinaux est tombé à zéro à ce moment-là.
Pour commencer, conservez les rats infectés par Strongyloides ratti dans des cages avec plusieurs couches de cellulose et une litière minimale aux jours cinq et 12 après l’infection. Les jours 6 à 8 et 13 à 15 après l’infection, transférez les rats dans des cages fraîches et collectez toutes les boulettes fécales des anciennes cages. Rassemblez les excréments collectés d’une cage dans un seul tube de 50 millilitres.
Prenez le charbon actif pré-trempé et lavez-le avant utilisation. Mélangez les excréments avec du charbon actif pré-trempé en quantités égales. Disposez le mélange en diagonale pour former un dégradé et recouvrez-le d’une couche supplémentaire de charbon actif pour atteindre un rapport final de 1 à 2.
Ensuite, couvrez le bécher en verre d’un film transparent, en veillant à ce que des trous d’aération soient faits pour permettre une bonne circulation de l’air.
