La Organización Mundial de la Salud estima que una de cada cuatro personas en este planeta está infectada con gusanos parásitos conocidos como helmintos. Nuestro objetivo es comprender cómo se inicia, regula y ejecuta la respuesta inmunitaria protectora contra los helmintos. Los helmintos sobreviven dentro de los huéspedes mamíferos durante décadas, al menos el tiempo suficiente para reproducirse, incluso cuando se enfrentan a una fuerte respuesta inmunitaria.
Ahora estamos empezando a entender cómo estos parásitos manipulan, evaden y suprimen la respuesta inmunitaria de su huésped para prolongar su supervivencia. Un desafío en el estudio de la infección por Strongyloides Ratti es la migración especial de este parásito, que se produce predominantemente a través del tejido hacia la cabeza y el intestino. Al cuantificar las larvas migratorias en la cabeza y el intestino, podemos diseccionar diferentes efectores inmunológicos en diferentes sitios.
Nuestro grupo estableció que los mastocitos y los campos basales son completamente prescindibles para la migración de tejidos, pero son esenciales para la eyección de S. ratti del intestino. Por el contrario, los campos neutros no juegan un papel importante en la inmunidad intestinal, pero son esenciales para matar las larvas migratorias en el tejido. Durante mi estudio de las diferencias sexuales en la infección por S. ratti, observé que tanto los ratones machos como las hembras tenían un número similar de larvas migratorias en su tejido.
Sin embargo, encontré un mayor número de parásitos en el intestino de los ratones machos en comparación con los ratones hembra. Esto sugiere que la inmunidad intestinal varía entre los sexos biológicos. Para empezar, prepare el aparato de Baermann.
Con una abrazadera, cierre la parte inferior de la manguera en un ángulo oblicuo y llene el aparato con agua tibia hasta que el tamiz esté sumergido. Coloque una toallita de papel en el colador y llénelo con la mezcla de carbón vegetal de heces. A continuación, encienda la luz situada directamente detrás del aparato Baermann y permita que el iL3 viable migre activamente a través de la toallita.
Después de 30 minutos, abra brevemente la pinza para recoger las larvas asentadas en un tubo de 50 mililitros, minimizando el volumen tanto como sea posible. Luego, llene el tubo de 50 mililitros con PBS que contenga estreptomicina al 1%. Deje que las larvas se asienten en el fondo del tubo por gravedad a cuatro grados centígrados durante 30 minutos antes de eliminar el sobrenadante.
Después del tercer lavado, vuelva a suspender el pellet en 30-50 mililitros de estreptomicina de penicilina PBS dependiendo del tamaño del pellet. Inmediatamente antes de pipetear, agite la solución a medida que las larvas iL3 se asientan rápidamente y transfiera una gota de microlitro de la solución a un portaobjetos de microscopía. Inspeccione las gotas bajo un microscopio invertido con un aumento de 40 veces.
Asegúrese de que las larvas de iL3 se muevan vívidamente. Para empezar, prepare 1000 o 2000 larvas iL3 en PBS que contengan 1% de estreptomicina de penicilina utilizando el aparato de Baermann. Una vez que las larvas de iL3 se asienten por gravedad, use una jeringa de 0,5 mililitros para aspirar el sobrenadante lo más completamente posible, dejando aproximadamente 30 microlitros en el tubo.
Vuelva a suspender la suspensión iL3 moviendo el tubo o utilizando una jeringa de 0,5 mililitros y aspire la suspensión restante en la jeringa. Ahora levanta el ratón por el pescuezo y asegura una pata trasera. Por vía subcutánea, inyecte toda la solución que contiene las larvas iL3 en la almohadilla del pie en un ángulo plano y luego retraiga lentamente la jeringa.
Rocíe el abdomen y el cuello del ratón infectado con eutanasia con un desinfectante comercial. Con unas tijeras, corta la piel sobre el abdomen y tira de ella hacia atrás para revelar la pared abdominal anterior. Después de abrir la cavidad peritoneal, corte el diafragma y abra las costillas a ambos lados para exponer los pulmones en la cavidad pleural.
Luego, recoja los lóbulos pulmonares en una placa de 24 pocillos marcada con líneas dibujadas o impresas de aproximadamente cuatro milímetros y llena con un mililitro de agua del grifo por pozo. Ahora, corta todo el pulmón en seis piezas, cada una de aproximadamente 0,75 centímetros por 0,75 centímetros. Después de cortar la cabeza del ratón, retire la piel y el pelaje con los dedos, minimizando la eliminación de tejido muscular.
Disecciona la cabeza completa en cuatro cuartos cortando detrás de los ojos y longitudinalmente a través del centro de la cabeza. Coloque los cuadrantes anterior y posterior en un plato de seis pocillos que contenga dos mililitros de agua del grifo. Después de la incubación, agite las placas por última vez, luego retire las partes de tejido restantes de los pocillos con pinzas y deséchelas.
Cuente todas las larvas en los pocillos bajo un microscopio invertido 40 veces. Siga las líneas en el fondo de los pozos para asegurar un conteo completo. Después de remojar la región abdominal en un desinfectante comercial, corte la piel sobre el abdomen con unas tijeras y tire de ella hacia atrás para exponer la pared abdominal anterior.
Hacer una incisión en la línea media para abrir la cavidad peritoneal. Con unas tijeras, corte entre el estómago y el duodeno proximal, así como entre el colon y el ano para separar todo el intestino. Luego, con los dedos, extraiga suavemente el intestino y colóquelo en una placa de Petri que contenga agua del grifo.
Corta las secciones del intestino longitudinalmente y agítalas vigorosamente en agua del grifo durante al menos 10 segundos para eliminar las heces y la mucosidad. Transfiera las secciones intestinales limpias a tubos de 50 mililitros que contengan 20 mililitros de agua del grifo e incube. Después de tres horas de incubación, retire el tejido intestinal del agua.
Coloque los tubos verticalmente a temperatura ambiente y deje que los parásitos se sedimenten por gravedad durante 30 minutos. Aspire el sobrenadante hasta que queden aproximadamente cinco mililitros de agua en el tubo. Vuelva a llenar el tubo con agua del grifo hasta un volumen total de 25 mililitros.
Cuando la visibilidad de la suspensión sea clara, aspire el sobrenadante hasta que queden aproximadamente cinco mililitros de agua. Transfiera este líquido a dos pocillos por intestino de ratón en una placa de seis pocillos marcados con líneas. Cuente los parásitos hembra adultos bajo un microscopio invertido con un aumento de 40 veces moviéndose a lo largo de las líneas dibujadas en el fondo de los pozos.
Las larvas se detectaron por primera vez en la cabeza el primer día después de la infección, mostrando una distribución uniforme, con una pequeña fracción también recuperada de los pulmones. El número de larvas en la cabeza aumentó significativamente en el segundo día después de la infección, con un promedio de 174 larvas en la cabeza y 17 larvas en los pulmones. El número de larvas en la cabeza disminuyó notablemente al tercer día después de la infección, y no se recuperaron larvas de la cabeza al cuarto día.
Los parásitos se detectaron en el intestino desde el cuarto día después de la infección, con la mayoría localizados en el duodeno y los primeros dos tercios del yeyuno persistiendo hasta el sexto día. Al séptimo día después de la infección, la mayoría de los parásitos adultos se localizaron en el ciego, donde persistieron hasta el día nueve, antes de que su número comenzara a disminuir significativamente para el día 11. No se recuperaron adultos parásitos del intestino el día 14 después de la infección, y el número total de parásitos intestinales se redujo a cero en este momento.
Para empezar, mantenga a las ratas infectadas con Strongyloides ratti en jaulas con varias capas de celulosa y un mínimo de arena a los cinco y 12 días después de la infección. En los días 6 a 8 y 13 a 15 después de la infección, transfiera las ratas a jaulas frescas y recoja todos los gránulos fecales de las jaulas viejas. Agrupa las heces recolectadas de una jaula en un solo tubo de 50 mililitros.
Tome el carbón activado previamente empapado y lávelo antes de usarlo. Mezcle las heces con carbón activado previamente remojado en cantidades iguales. Coloque la mezcla en diagonal para formar un degradado y cúbrala con una capa adicional de carbón activado para alcanzar una proporción final de 1 a 2.
Luego, cubra el vaso de vidrio con una película transparente, asegurándose de que los orificios de aire estén hechos para permitir la circulación de aire adecuada.
