Die Weltgesundheitsorganisation schätzt, dass jeder vierte Mensch auf diesem Planeten mit parasitären Würmern infiziert ist, die als Helminthen bekannt sind. Unser Ziel ist es zu verstehen, wie die schützende Immunantwort gegen Helminthen initiiert, reguliert und ausgeführt wird. Helminthen überleben in den Wirtstieren der Säugetiere jahrzehntelang, zumindest lange genug, um sich fortzupflanzen, selbst wenn sie mit einer starken Immunantwort konfrontiert sind.
Wir beginnen jetzt zu verstehen, wie diese Parasiten die Immunantwort ihres Wirts manipulieren, umgehen und unterdrücken, um ihr Überleben zu verlängern. Eine Herausforderung bei der Untersuchung der Strongyloides-Ratti-Infektion ist die spezielle Wanderung dieses Parasiten, die überwiegend durch das Gewebe in den Kopf und Darm erfolgt. Durch die Quantifizierung wandernder Larven im Kopf und Darm können wir verschiedene Immuneffektoren an verschiedenen Stellen zerlegen.
Unsere Gruppe stellte fest, dass Mastzellen und Basalfelder für die Gewebemigration vollständig entbehrlich sind, aber für den Ausstoß von S. ratti aus dem Darm unerlässlich sind. Im Gegensatz dazu spielen neutrale Felder keine wichtige Rolle für die Immunität im Darm, sind aber essentiell für die Abtötung wandernder Larven im Gewebe. Während meiner Studie über Geschlechtsunterschiede bei S.ratti-Infektionen beobachtete ich, dass sowohl männliche als auch weibliche Mäuse eine ähnliche Anzahl von wandernden Larven in ihrem Gewebe hatten.
Allerdings fand ich bei männlichen Mäusen eine höhere Parasitenzahl im Darm im Vergleich zu weiblichen Mäusen. Dies deutet darauf hin, dass die Darmimmunität zwischen den biologischen Geschlechtern variiert. Bereiten Sie zunächst das Baermann-Gerät vor.
Schließen Sie den Schlauchboden mit einer Klemme in einem schrägen Winkel und füllen Sie das Gerät mit lauwarmem Wasser, bis das Sieb untergetaucht ist. Legen Sie ein Taschentuchtuch in das Sieb und füllen Sie es mit der Kot-Holzkohle-Mischung. Schalten Sie dann das Licht ein, das direkt hinter dem Baermann-Gerät positioniert ist, und lassen Sie lebensfähiges iL3 aktiv durch das Tuch wandern.
Öffnen Sie nach 30 Minuten kurz die Klemme, um die abgesetzten Larven in einem 50-Milliliter-Röhrchen zu sammeln und das Volumen so weit wie möglich zu minimieren. Füllen Sie dann die 50-Milliliter-Tube mit PBS, das 1% Penicillin-Streptomycin enthält. Lassen Sie die Larven 30 Minuten lang durch die Schwerkraft bei vier Grad Celsius am Boden des Röhrchens absetzen, bevor Sie den Überstand entfernen.
Nach der dritten Wäsche suspendieren Sie das Pellet je nach Pelletgröße in 30-50 Millilitern PBS-Penicillin-Streptomycin. Unmittelbar vor dem Pipettieren rühren Sie die Lösung, während sich die iL3-Larven schnell absetzen, und übertragen Sie einen Mikroliter der Lösung auf einen Objektträger. Untersuchen Sie die Tröpfchen unter einem inversen Mikroskop bei 40-facher Vergrößerung.
Stellen Sie sicher, dass sich die iL3-Larven lebhaft bewegen. Bereiten Sie zunächst 1000 oder 2000 iL3-Larven in PBS mit 1 % Penicillin-Streptomycin mit dem Baermann-Gerät vor. Sobald sich die iL3-Larven durch die Schwerkraft festgesetzt haben, verwenden Sie eine 0,5-Milliliter-Spritze, um den Überstand so vollständig wie möglich abzusaugen, wobei etwa 30 Mikroliter im Röhrchen verbleiben.
Resuspendieren Sie die iL3-Suspension, indem Sie den Schlauch schnippen oder eine 0,5-Milliliter-Spritze verwenden und die restliche Suspension in die Spritze aspirieren. Nimm nun die Maus am Schopf und fixiere einen Hinterfuß. Injizieren Sie subkutan die gesamte Lösung, die die iL3-Larven enthält, in einem flachen Winkel in das Fußpolster und ziehen Sie dann die Spritze langsam zurück.
Besprühen Sie den Bauch und Hals der euthanasierten, infizierten Maus mit einem handelsüblichen Desinfektionsmittel. Schneiden Sie mit einer Schere die Haut über dem Bauch ab und ziehen Sie sie zurück, um die vordere Bauchdecke freizulegen. Nach dem Öffnen der Bauchhöhle das Zwerchfell durchtrennen und die Rippen zu beiden Seiten öffnen, um die Lunge in der Pleurahöhle freizulegen.
Sammeln Sie dann die Lungenlappen in einer 24-Well-Platte, die mit etwa vier Millimetern gezeichneten oder gedruckten Linien markiert ist, und füllen Sie sie mit einem Milliliter Leitungswasser pro Well. Schneide nun die gesamte Lunge in sechs Stücke mit einer Größe von jeweils etwa 0,75 mal 0,75 Zentimetern. Nachdem Sie den Kopf der Maus abgeschnitten haben, entfernen Sie die Haut und das Fell mit den Fingern, um die Entfernung von Muskelgewebe zu minimieren.
Präparieren Sie den kompletten Kopf in vier Viertel, indem Sie hinter den Augen und in Längsrichtung durch die Mitte des Kopfes schneiden. Legen Sie den vorderen und hinteren Quadranten in eine Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern Leitungswasser. Schwenken Sie die Platten nach der Inkubation ein letztes Mal, entfernen Sie dann die restlichen Gewebeteile mit einer Pinzette aus den Vertiefungen und entsorgen Sie sie.
Zählen Sie alle Larven in den Vertiefungen unter einem 40-fach inversen Mikroskop. Befolgen Sie die Linien auf den Brunnenböden, um eine vollständige Zählung zu gewährleisten. Nachdem Sie die Bauchregion in einem handelsüblichen Desinfektionsmittel getränkt haben, schneiden Sie die Haut über dem Bauch mit einer Schere ab und ziehen Sie sie zurück, um die vordere Bauchdecke freizulegen.
Machen Sie einen Schnitt in der Mittellinie, um die Bauchhöhle zu öffnen. Schneiden Sie mit einer Schere zwischen dem Magen und dem proximalen Zwölffingerdarm sowie zwischen dem Dickdarm und dem Anus, um den gesamten Darm zu lösen. Ziehen Sie dann mit den Fingern vorsichtig den Darm heraus und legen Sie ihn in eine Petrischale mit Leitungswasser.
Schneiden Sie die Darmabschnitte längs auf und schütteln Sie sie mindestens 10 Sekunden lang kräftig in Leitungswasser, um Kot und Schleim auszuwaschen. Die gereinigten Darmabschnitte werden in 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern Leitungswasser umgefüllt und inkubiert. Entfernen Sie nach dreistündiger Inkubation das Darmgewebe aus dem Wasser.
Stellen Sie die Röhrchen senkrecht bei Raumtemperatur auf und lassen Sie die Parasiten 30 Minuten lang durch die Schwerkraft sedimentieren. Saugen Sie den Überstand an, bis etwa fünf Milliliter Wasser im Rohr verbleiben. Füllen Sie die Tube mit Leitungswasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 Millilitern.
Wenn die Sicht auf die Suspension klar ist, saugen Sie den Überstand an, bis etwa fünf Milliliter Wasser übrig sind. Füllen Sie diese Flüssigkeit in zwei Vertiefungen pro Mausdarm in eine mit Linien markierte Sechs-Well-Platte. Zählen Sie die erwachsenen weiblichen Parasiten unter einem inversen Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung, indem Sie sich entlang der Linien bewegen, die auf den Brunnenböden gezeichnet sind.
Die Larven wurden erstmals am ersten Tag nach der Infektion im Kopf nachgewiesen und zeigten eine gleichmäßige Verteilung, wobei ein kleiner Teil auch aus der Lunge entnommen wurde. Die Anzahl der Larven im Kopf stieg am zweiten Tag nach der Infektion deutlich an, mit durchschnittlich 174 Larven im Kopf und 17 Larven in der Lunge. Die Anzahl der Larven im Kopf nahm am dritten Tag nach der Infektion deutlich ab, wobei am vierten Tag keine Larven mehr aus dem Kopf entnommen wurden.
Parasiten wurden ab dem vierten Tag nach der Infektion im Darm nachgewiesen, wobei die Mehrheit im Zwölffingerdarm lokalisiert war und die ersten zwei Drittel des Jejunums bis zum sechsten Tag persistierten. Am siebten Tag nach der Infektion waren die meisten adulten Parasiten im Blinddarm lokalisiert, wo sie bis zum neunten Tag persistierten, bevor ihre Anzahl bis zum 11. Tag deutlich zurückging. Am 14. Tag nach der Infektion wurden keine parasitären adulten Tiere aus dem Darm entnommen, und die Gesamtzahl der Darmparasiten sank zu diesem Zeitpunkt auf Null.
Zu Beginn halten Sie Ratten, die mit Strongyloides ratti infiziert sind, an den Tagen fünf und 12 nach der Infektion in Käfigen mit mehreren Schichten Zellulose und minimaler Einstreu. Bringen Sie die Ratten an den Tagen 6 bis 8 und 13 bis 15 nach der Infektion in frische Käfige und sammeln Sie alle Kotpellets aus den alten Käfigen. Sammeln Sie den gesammelten Kot aus einem Käfig in einem einzigen 50-Milliliter-Röhrchen.
Nehmen Sie die eingeweichte Aktivkohle und waschen Sie sie vor dem Gebrauch. Mischen Sie den Kot mit voreingeweichter Aktivkohle in gleichen Mengen. Ordnen Sie die Mischung diagonal an, um einen Gradienten zu bilden, und bedecken Sie sie mit einer zusätzlichen Schicht Aktivkohle, um ein Endverhältnis von 1 zu 2 zu erreichen.
Decken Sie dann den Glasbecher mit einer transparenten Folie ab und stellen Sie sicher, dass Luftlöcher vorhanden sind, um eine gute Luftzirkulation zu ermöglichen.
