세계보건기구(WHO)는 지구상에 사는 사람 4명 중 1명이 기생충으로 알려진 기생충에 감염된 것으로 추정합니다. 우리는 기생충에 대한 보호 면역 반응이 어떻게 시작되고, 조절되고, 실행되는지 이해하는 것을 목표로 합니다. 기생충은 포유류 숙주 내에서 수십 년 동안 생존하며, 적어도 강력한 면역 반응에 직면하더라도 번식할 수 있을 만큼 충분히 오래 생존합니다.
우리는 이제 이 기생충이 생존을 연장하기 위해 숙주의 면역 반응을 어떻게 조작하고, 회피하고, 억제하는지 이해하기 시작했습니다. 스트롱길로이드 라티(Strongyloides Ratti) 감염을 연구하는 데 있어 어려운 점은 이 기생충이 주로 조직을 통해 머리와 장으로 이동하는 특별한 이동입니다. 머리와 장에서 이동하는 유충을 정량화함으로써 서로 다른 부위에서 다양한 면역 효과기를 해부할 수 있습니다.
우리 그룹은 비만 세포와 기저장이 조직 이동에 완전히 필수적이지만 장에서 S.ratti를 배출하는 데 필수적이라는 것을 확인했습니다. 대조적으로, 중성장은 장 면역에 중요한 역할을 하지 않지만 조직에서 이동하는 유충을 죽이는 데 필수적입니다. S.ratti 감염의 성별 차이에 대해 연구하는 동안, 저는 수컷과 암컷 쥐 모두 조직에서 비슷한 수의 이동하는 유충을 가지고 있음을 관찰했습니다.
그러나 나는 암컷 쥐에 비해 수컷 쥐의 장에서 더 높은 기생충 수를 발견했습니다. 이는 장 면역이 생물학적 성별에 따라 다르다는 것을 시사합니다. 시작하려면 Baermann 장치를 준비합니다.
클램프를 사용하여 호스 바닥을 비스듬한 각도로 닫고 체가 잠길 때까지 미지근한 물로 장치를 채 웁니다. 체에 티슈 물티슈를 넣고 대변 숯 혼합물로 채웁니다. 그런 다음 Baermann 장치 바로 뒤에 있는 조명을 켜고 실행 가능한 iL3가 와이프를 통해 활발하게 이동할 수 있도록 합니다.
30분 후 클램프를 잠시 열어 침전된 유충을 50ml 튜브에 모아 부피를 최대한 최소화합니다. 그런 다음 50ml 튜브에 1%페니실린 스트렙토마이신이 함유된 PBS를 채웁니다. 유충이 상층액을 제거하기 전에 섭씨 4도의 중력에 의해 30분 동안 튜브 바닥에 정착하도록 합니다.
세 번째 세척 후 펠릿 크기에 따라 30-50ml의 PBS 페니실린 스트렙토마이신에 펠릿을 다시 현탁시킵니다. 피펫팅 직전에 iL3 유충이 빠르게 정착할 때 용액을 교반하고 용액 1마이크로리터 방울을 현미경 슬라이드로 옮깁니다. 도립 현미경으로 40배 배율로 액적을 검사합니다.
iL3 유충이 생생하게 움직이고 있는지 확인합니다. 시작하려면 Baermann 장치를 사용하여 1%페니실린 스트렙토마이신을 함유한 PBS에서 1000개 또는 2000개의 iL3 유충을 준비합니다. iL3 유충이 중력에 의해 정착하면 0.5ml 주사기를 사용하여 상층액을 최대한 완전히 흡인하고 튜브에 약 30μl를 남깁니다.
튜브를 튕기거나 0.5ml 주사기를 사용하여 iL3 현탁액을 다시 현탁액을 부유하고 남은 현탁액을 주사기에 흡입합니다. 이제 목덜미를 잡고 뒷발을 한 번 고정합니다. 피하에서 iL3 유충이 포함된 전체 용액을 평평한 각도로 발 패드에 주입한 다음 주사기를 천천히 집어넣습니다.
안락사되고 감염된 쥐의 복부와 목에 상업용 소독제를 뿌립니다. 가위를 사용하여 복부 위의 피부를 자르고 뒤로 당겨 복부 벽을 드러냅니다. 복막강을 연 후 횡격막을 절단하고 갈비뼈를 양쪽으로 열어 흉막강의 폐를 노출시킵니다.
그런 다음 폐엽을 약 4mm로 그려지거나 인쇄된 선으로 표시되고 우물당 1ml의 수돗물로 채워진 24웰 플레이트에 수집합니다. 이제 폐 전체를 각각 약 0.75cm x 0.75cm씩 6등분으로 자른다. 마우스의 머리를 자른 후 손가락을 사용하여 피부와 털을 제거하여 근육 조직의 제거를 최소화합니다.
눈 뒤를 자르고 머리 중앙을 세로로 잘라 머리 전체를 4등분합니다. 전방 및 후방 사분면을 2ml의 수돗물이 들어있는 6 웰 플레이트에 놓습니다. 배양 후 플레이트를 마지막으로 한 번 휘젓은 다음 집게를 사용하여 웰에서 나머지 조직 부분을 제거하고 폐기합니다.
40 번 도립 현미경으로 우물에있는 모든 유충을 세십시오. 완전한 계수를 보장하기 위해 우물 바닥의 선을 따르십시오. 시판되는 소독제에 복부를 담근 후 가위로 복부 위의 피부를 절개하고 뒤로 당겨 복부 벽을 노출시킵니다.
복막강을 열기 위해 정중선을 절개합니다. 가위를 사용하여 위와 근위 십이지장 사이, 결장과 항문 사이를 잘라 장 전체를 분리한다. 그런 다음 손가락을 사용하여 장을 부드럽게 당겨 수돗물이 담긴 페트리 접시에 넣습니다.
장부분을 세로로 잘라 수돗물에 10초 이상 세게 흔들어 대변과 점액을 씻어냅니다. 세척된 장 부분을 20ml의 수돗물이 들어 있는 50ml 튜브로 옮기고 배양합니다. 배양 3시간 후 물에서 장 조직을 제거합니다.
튜브를 실온에 수직으로 놓고 기생충이 중력에 의해 30분 동안 침전되도록 합니다. 튜브에 약 5ml의 물이 남을 때까지 상등액을 흡입합니다. 튜브에 총 25ml의 수돗물을 다시 채웁니다.
현탁액의 가시성이 명확해지면 약 5ml의 물이 남을 때까지 상층액을 흡입합니다. 이 액체를 선으로 표시된 6웰 플레이트에 있는 마우스 장당 2개의 웰로 옮깁니다. 우물 바닥에 그려진 선을 따라 이동하여 40배 배율의 거꾸로 된 현미경으로 성인 암컷 기생충을 세십시오.
유충은 감염 후 첫날에 머리에서 처음 발견되었으며, 균일한 분포를 보였으며 폐에서도 작은 부분이 제거되었습니다. 감염 후 2일차에 머리에 있는 유충의 수가 크게 증가하여 머리에 평균 174마리의 유충, 폐에 17마리의 유충이 있었습니다. 머리에 있는 유충의 수는 감염 후 3일째까지 현저히 감소했으며, 4일째에는 머리에서 유충이 발견되지 않았습니다.
기생충은 감염 후 4일째부터 장에서 발견되었으며, 대다수는 십이지장에 국한되어 있고 제주넘의 처음 2/3는 6일째까지 지속되었습니다. 감염 후 7일째가 되자 대부분의 성충은 맹장에 국한되어 9일째까지 지속되다가 11일째가 되자 그 수가 크게 감소하기 시작했습니다. 감염 후 14일째 되는 날에는 장에서 기생충 성체가 채취되지 않았으며, 이 시점까지 총 장내 기생충 수는 0으로 떨어졌다.
우선, Strongyloides ratti에 감염된 쥐를 감염 후 5일과 12일에 여러 겹의 셀룰로오스와 최소한의 배설물이 있는 우리에 가두십시오. 감염 후 6-8일과 13-15일째에 쥐를 새 우리로 옮기고 오래된 우리에서 모든 배설물 알갱이를 수집합니다. 한 케이지에서 수집된 대변을 하나의 50ml 튜브에 모읍니다.
미리 불린 활성탄을 가지고 씻은 후 사용하십시오. 대변을 미리 불린 활성탄과 같은 양으로 섞습니다. 혼합물을 대각선으로 배열하여 그라디언트를 형성하고 활성탄의 추가 층으로 덮어 최종 비율 1:2에 도달합니다.
그런 다음 유리 비커를 투명 필름으로 덮고 적절한 공기 순환이 가능하도록 공기 구멍이 만들어졌는지 확인합니다.
