Richard W. Beringer ve David L. Ash, teknik yardım ve film çekimi için başvurular Bilim adamları, Thermo Scientific NanoDrop ürünleri.

1. Microvolume Nükleik Asit Niceleme NanoDrop 2000c Spektrofotometre <ol><li> Başlamak için, optik alt yüzeye temiz deiyonize su 2 - 3 mcL pipetleme microvolume spektrofotometre numune tutma sistemi, üst ve alt optik yüzeyler temiz. </li><li> Üst kaide deiyonize su ile temas halinde gelir sağlamak, kol kapatın. Kol kaldırın ve her iki optik yüzeyler temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin silin. </li><li> NanoDrop yazılımını açın ve Nükleik Asit uygulamayı seçin. Optik alt yüzeye tampon 1 mcL dağıtım boş bir ölçüm gerçekleştirmek için küçük bir hacim, kalibre pipet kullanın. Alt kol ve Nükleik Asit uygulaması &quot;Boş&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Sonra boş bir ölçüm tamamlandığında, optik yüzeyler hem de temiz temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin. </li><li> Ölçülecek numune için uygun sabit seçin. <table border="1"><tbody><tr><td> Örnek Türü </td><td> Seçenek Seçin </td><td> Konsantrasyonunun hesaplanması için kullanılan sabit </td></tr><tr><td> dsDNA </td><td> DNA-50 </td><td> 50 </td></tr><tr><td> ssDNA </td><td> DNA-33 </td><td> 33 </td></tr><tr><td> RNA </td><td> RNA-40 </td><td> 40 </td></tr><tr><td> Oligo </td><td> Özel </td><td> 15-150 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Tipik bir NanoDrop microvolume spektrofotometre, TrayCell Microcell küvet ile kullanılan geleneksel bir küvet tabanlı spektrofotometre ve PicoGreen testi ile birlikte bir microvolume NanoDrop fluorospectrometer kullanarak doğrudan A280 absorbans ölçümleri için nükleik asit konsantrasyon aralıkları. </li><li> 1 mcL nükleik asit örnek optik alt kaide üzerine koyun ve kol kapatın. Ölçümü bağımsız ses olduğundan, örnek, sadece yapılacak bir ölçüm için iki optik yüzeyler arasında köprü gerekir. </li><li> Uygulama yazılımı &quot;Ölçü&quot; i seçin. Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, spektral çıktısını gözden geçirin. </li><li> Yazılım otomatik olarak nükleik asit konsantrasyonu ve saflık oranları hesaplar. Örnek ölçüm ardından, örnek kalitesini değerlendirmek için spektral görüntü gözden geçirin. </li><li> Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1: Tipik bir nükleik asit örneği çok karakteristik bir profile sahip. </li><li> Ortak spesifik nükleik asit izolasyon teknikleri ile ilişkili bulaşanların kaynakları Fenol / Trizol ve sütun çıkarma içerir. Fenol / Trizol çıkarma durumda, kalıntı reaktif kontaminasyonu 220 - 240 nm arasında anormal spektrumları yanı sıra 260-280 nm bölgede vardiya endike olabilir. Tersine, sütun çıkarma artık guanidin tepe ve çukur bir kayma yaklaşık 240 nm 230 nm 230 nm yakın bir katkıda bulunabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig2.jpg" alt="Şekil 2" /> Şekil 2, B ve C örnekleri zirveler ve dipler vardiya olarak kirleticiler, nükleik asit örneklerinin spektrumları nasıl etkilediğini göstermek örnek kıyasla. </li><li> Doğru örnek kalitesini değerlendirmek için, 260/280 ve 260/230 oranları genel spektral kalite ile birlikte analiz edilmelidir. Saf nükleik asitler genellikle sırasıyla ~ 1.8 oranı 260/280 ve 260/280 oranı ~ 2.0 DNA ve RNA için bir verim. Bu oran, boş ve örnek ölçümleri yapmak için kullanılan tampon pH ve iyonik kuvvet bağlıdır. Asidik çözümler temel bir çözüm 0.2-0.3 oranı fazla temsil edecek iken, 0.2-0.3 oranı altında temsil edecek. Önemli ölçüde farklı saflık oranları, 280 nm veya yakınındaki kuvvetle absorbe protein, fenol ya da diğer kirleticiler varlığına işaret edebilir. 260/230 saflık oranı 1.8-2.2 aralığında yaygın bir &quot;saf&quot; nükleik asit değerleri ile DNA saflık ikinci bir ölçüsüdür. Saflık beklenen değerlere göre anlamlı derecede düşük oranlar kullanılan izolasyon tekniği daha fazla optimizasyon isteyebilir gösterebilir. </li><li> NanoDrop spektrofotometreler da doğrudan absorbans kullanarak protein ya da protein kolorimetrik testleri ile ölçmek için kullanılabilir. Uygun sütun oluşumu ve tekrarlanabilirlik sağlamak için, 2-ul örnekleri protein örnekleri için tavsiye edilir. Aşağıdaki vallahi video bakın: Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini <a href="https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610">https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610</a> NanoDrop Spektrofotometre </li></ol><ol><li> NanoDrop 3300 kullanarak yüksek hassasiyetli microvolume nükleik asit kantitatif göstermek için, bir PicoGreen floresan kiti kullanılır. Başlamak için, oda sıcaklığına kadar kiti standartları ve nükleik asit örneklerinin dengelenmesi. Floresan örnekleri ışığa duyarlı ve kehribar veya alüminyum sarılmış tüpler tutulmalıdır. </li><li> , Gerekli olacak PicoGreen çalışma çözeltisinin yanı sıra ölçülebilir tüm standartlar ve örnekler için yeterli 1x TE tampon hazırlayın. 20x TE tampon üreticinin protokol başına nükleaz içermeyen su ile seyreltilmesi ile 1xTE tampon hazırlayın. Reaksiyon hacmi 200 mcL kadar az 10 ul uzanabilir. Bu örnekte, 10 mcL reaksiyon hacmi hazırlanacaktır. </li><li> Nükleaz şişeleri ya da tüpler 2x nihai istenen konsantrasyona seri seyreltilmiş dsDNA standartları hazırlayın. Nükleaz içermeyen amber veya folyo kaplı tüp etiketli bir birey haline seyreltilmiş dsDNA standartlarını her 5 mcL aktarın. </li><li> Uygun etiketli nükleaz içermeyen sarı veya folyo kaplı tüpler içine ilgi her dsDNA örnek kısım 5 mcL. </li><li> Üretici firmanın protokolüne göre PicoGreen çalışma çözeltisi hazırlayın. PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimde bir ilgi standart ya da numune (bu örnekte 5 mcL) da içeren her tüp aktarın. </li><li> Bir referans çözüm olarak hizmet veren negatif kontrol hazırlamak, 1x TE tampon ve PicoGreen çalışma çözeltisi eşit hacimlerde birleştirin. </li><li> Nazik pipetleme ile iyice karıştırın ve Her reaksiyon tüpü içeriğini reaksiyonların, oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Floresan sinyal sıcaklığından etkilenir gibi tüm standartlar ve örnekler önce aynı ölçüm sıcaklığına gelmesi beklenmelidir. </li><li> Alet hazırlamak ve ölçümlerini yapmak, ilk numune tutma sistemi alt ve üst yüzeyleri temizlemek. Optik alt yüzeye deiyonize su pipetleyin 2 3 mcL yakın, sonra kol ve temiz, havsız ile alt ve üst kaideleri blot, laboratuvar silin. Yüzeyleri tüy bırakmayan bir floresan bir uyarım kaynağının varlığını gösterirler ve ölçümü ile karışabilir geçmeden önce tüy bırakmayan ücretsiz olun. </li><li> , Cihazın yazılımını açın &quot;Nükleik Asitler&quot; uygulamasını seçin ve &quot;PicoGreen-dsDNA&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Araç boş için, alt kaide 1x TE 2 mcL ekleyin, kol kapatın ve cihaz yazılımı alanında &quot;Boş&quot; seçeneğini seçin. Boş komple sonra, numune tutma sistemi her iki yüzeyine boş bir çözüm kurulayın. </li><li> Nazik pipetleme referans çözüm karıştırın. Alt kaide üzerine düşük tutma ipuçları, pipet 2 mcL kullanma ve kol yakın. </li><li> Ölçüm tipi &quot;Referans&quot; seçin ve istenilen birimleri seçin. Ölçüm döngüsü başlatmak için &quot;Ölçü&quot; ı tıklayın. </li><li> Ölçüm döngüsü tamamlandığında, kol açık ve iyice kurulayın numune tutma sistemi yüzeyler. Beş kadar ölçüm her çoğaltmak için taze bir kısım kullanarak, referans çoğaltır. </li><li> Standart bir eğri oluşturmak için ek standartlar için bu işlemi tekrarlayın. Kadar yedi standartları kullanılıyor olabilir. Bu yazılım, her standart için beş çoğaltır kadar saklamak için tasarlanmıştır. Standartların çoğaltır örnek konsantrasyonları otomatik olarak belirlendiği ve standart bir eğri oluşturmak için ortalaması alınır. </li><li> Standart eğri tamamlandıktan sonra, &quot;Örnekler&quot; sekmesini seçin, ilgili örnek kimlik bilgilerini girin ve her bilinmeyen numune ölçün. </li></ol>

<ol>
	<li>Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+pH+and+Ionic+Strength+on+the+Spectrophotometric+Assessment+of+Nucleic+Acid+Purity.">Effect of pH and Ionic Strength on the Spectrophotometric Assessment of Nucleic Acid Purity.</a> BioTechniques. 22, 474-481 (1997).</li><li>Voolstra, C., Jungnickel, A., Borrmann, L., Kirchner, R., Huber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectrophotometric+Quantification+of+Nucleic+Acids:+LabelGuard+enables+photometric+quantification+of+submicroliter+samples+using+a+standard+photometer.">Spectrophotometric Quantification of Nucleic Acids: LabelGuard enables photometric quantification of submicroliter samples using a standard photometer.</a> Implen Applications Note. , (2006).</li><li>Jr, I. n. g. l. e., D, J., Crouch, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Spectrochemical analysis. , XV-590 (1988).</li><li>Van Lancker, M., Gheyssens, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+four+frequently+used+assays+for+quantitative+determination+of+DNA.">A comparison of four frequently used assays for quantitative determination of DNA.</a> Anal. Lett. 19, 615-623 (1986).</li></ol>

Philippe Desjardins ve Debra Conklin Bu makalede kullanılan aletleri üreten Thermo Scientific NanoDrop Ürünler, Inc tarafından istihdam edilmektedir.

Burada sunulan kantitatif protokolleri en yaygın kabul gören microvolume sistemleri dayanmaktadır. Bu tür sistemler daha fazla numune hacimleri ve çevreleme cihazların kullanımı güveniyor geleneksel nükleik asit kantitatif metodoloji için pratik alternatifler sağlar. NanoDrop microvolume teknolojisi, yüzey gerilimi özellikleri üzerine bir sıvı sütunu oluşturmak için ölçülen örnek güvenir bir örnek tutma sistemi kullanmaktadır. Bu örnek, uygun sütun oluşumu için alt ve üst optik ölçüm yüzeyleri ile temas yaptığı esastır. Eğer herhangi bir noktada ölçüm sonuçlarının yanlış ya da tekrarlanabilir değil gibi görünüyor, büyük olasılıkla örnek heterojenite veya sıvı sütun kırılması sonucu. Deterjan ve temizlik maddeleri, kaide ölçüm yüzeyleri uncondition olarak izopropil alkol tavsiye edilmez. Koşulsuz kaide örnek damlacık bir düzleşme, kaide hidrofobik yüzey özellikleri uzlaşılan olduğu zaman oluşur. Koşulsuz kaideleri ölçüm sırasında sıvı sütunun kırılmaya yol açabilir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3 koşulsuz yüzey, bir su damlasının bir düzleşme tarafından karakterize edilir . Uncondtioned kaide yüzeyleri NanoDrop Ayak Yenileme Bileşik (PR-1, Thermo Scientific NanoDrop Ürünleri) kullanılarak yenilenmiş olabilir. ~ 30 saniye süreyle kurumasına izin, üst ve alt kaide yüzeyleri, bileşik yenileme ince bir tabaka uygulanır, daha sonra temiz, kuru, tüy bırakmayan ücretsiz laboratuvar silin kullanarak ovuşturdu. Başarılı bir şekilde yenilenmiş bir devlet, bir su damlacığı alt kaide yüzeyine uygulandığında kadar boncuk ile karakterizedir. <img src="/files/ftp_upload/2565/2565fig4.jpg" alt="Şekil 4" /> Şekil 4 yenilenmiş bir yüzey, bir su damlasının bir boncuk tarafından karakterize edilir . Microvolume kantitatif sistemleri büyük ölçüde örnek tüketimini azaltmak ve daha geleneksel kantifikasyon sistemleri ile kıyaslandığında önemli ölçüde konsantrasyon aralığı artırmak. Microvolume kantitatif genellikle iğne biyopsileri ve lazer yakalama mikrodiseksiyon sınırlı hücre gibi kütle, verimlilik ve kolaylığı bu metodoloji yaptı yaygın olarak kabul gören alternatif geleneksel nükleik asit kantitatif yöntemleri içeren durumlar için elverişli bir teknoloji haline gelmiştir rağmen bile Örnek bol olduğu zaman.

<table><tbody><tr><td>NanoDrop 2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 3300</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>ND-3300</td><td></td></tr></tbody></table>

nanodrop microvolume quantitation of nucleic acids

Biyomoleküler deneyleri genellikle microvolume kantitatif gerçekleştirebileceğiniz bu nükleik asit kantitatif geleneksel küvet-temelli araçların kullanımını engelleyen, sürekli kullandığınız malzemenin giderek daha az miktarlarda gelişmiş ediliyor. NanoDrop microvolume numune tutma sistemi (Thermo Scientific NanoDrop Ürünler) Küvet veya kapiler gibi geleneksel çevreleme cihazların bağımsız örnek dakika miktarda yakalamak ve korumak için fiber optik teknoloji ve doğal yüzey gerilim özelliklerini birleştirerek fonksiyonları. Ayrıca, sistem, aslında dilüsyonları gerçekleştirmek için ihtiyacı ortadan kaldırır. Kısa yol uzunluklarında, nükleik asit konsantrasyon ölçümleri geniş bir yelpazede Sonuç olarak, istihdam Spektroskopik analiz için gerekli olan örnek hacminin azaltılması da dahil birçok moleküler iş akışları boyunca ek kalite kontrol adımları kolaylaştırır verimliliğin artırılması ve sonuçta aşağı sonuçlarında daha fazla güven. Sınırlı bir kitle yüksek hassasiyetli floresan analizi için ihtiyaç da deneysel son gelişmeler ile ortaya çıkmıştır. Aynı microvolume örnek saklama teknolojisini kullanarak, floresan ölçümler, floresan testleri hacim gereksinimleri önemli ölçüde azaltılabilir sağlayan 2 mcL malzeme ile olabilir. Bu mcL 10 veya daha az microreactions adanmış microvolume fluorospectrometer kullanarak artık mümkün. İki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri geleneksel küvet tabanlı protokoller için pratik alternatif olarak entegre numune tutma sistemleri kullanan gösterilecektir. Birincisi, bir microvolume spektrofotometre kullanarak doğrudan A260 absorbans yöntemi açıklanmıştır. Bu microvolume fluorospectrometer ile az hacimli floresan reaksiyonlar sağlayan bir floresan tabanlı bir yöntem bir gösteri izledi. Bu yeni teknikler 1 pg / ml numune en az tüketim ile 15.000 ng / ml arasında değişen nükleik asit konsantrasyonlarının değerlendirilmesi sağlar.

Watch this Scientific Journal Video about NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids at JoVE.com

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Pratik ve verimli bir alternatif olarak geleneksel nükleik asit kantitatif metodolojiye NanoDrop microvolume sistemlerinin kullanımı iki microvolume nükleik asit kantitatif protokolleri gösteri ile tarif edilir.

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

<a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2891"> &#x4E2D;&#x6587; </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2892"> Deutsch </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2893"> Fran&#231;ais </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/details.stp?ID=2894"> Espa&ntilde;ol </a>
 
 
 <a class="grey_button" href="http://www.jove.com/Details.stp?ID=2895"> &#x65E5;&#x672C;&#x8A9E; </a>

nanodrop-microvolume-quantitation-of-nucleic-acids

Research

JoVE Journal

Biology

201.5K Görüntüleme.  Thermo Scientific NanoDrop Products.  中文 Deutsch Français 

Video: NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often used for protein analysis. The Thermo Scientific NanoDrop 2000c Spectrophotometer solves this issue with an innovative sample retention system that holds microvolume samples between two measurement surfaces using the surface tension properties of liquids, enabling the quantification of samples in volumes as low as 0.5-2 &mu;L. The elimination of cuvettes or capillaries allows real time changes in path length, which reduces the measurement time while greatly increasing the dynamic range of protein concentrations that can be measured. The need for dilutions is also eliminated, and preparations for sample quantification are relatively easy as the measurement surfaces can be simply wiped with laboratory wipe. This video article presents modifications to traditional protein concentration determination methods for quantification of microvolume amounts of protein using A280 absorbance readings or the BCA colorimetric assay.

Microvolume samples are quantified by a spectrophotometer system that uses natural surface tension to retain samples without the use of cuvettes or capillaries. The dynamic range of protein concentrations and speed by which they can be measured are greatly increased with this method.

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Biyoloji

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Concentration Determination of Nucleic Acids and Proteins Using the Micro-volume Bio-spec Nano Spectrophotometer

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades. More and more, molecular biologists require consistent small-volume analysis of nucleic acid samples for their experiments. The BioSpec-nano provides a potential solution to the problems of inaccurate, non-reproducible results, inherent in current DNA quantitation methods, via specialized optics and a sensitive PDA detector. The BioSpec-nano also has automated functionality such that mounting, measurement, and cleaning are done by the instrument, thereby eliminating tedious, repetitive, and inconsistent placement of the fiber optic element and manual cleaning.
In this study, data is presented on the quantification of DNA and protein, as well as on measurement reproducibility and accuracy. Automated sample contact and rapid scanning allows measurement in three seconds, resulting in excellent throughput. Data analysis is carried out using the built-in features of the software. The formula used for calculating DNA concentration is:
Sample Concentration = DF &middot; (OD260-OD320)&middot; NACF (1)
Where DF = sample dilution factor and NACF = nucleic acid concentration factor.
The Nucleic Acid concentration factor is set in accordance with the analyte selected1.
Protein concentration results can be expressed as &mu;g/ mL or as moles/L by entering e280 and molecular weight values respectively. When residue values for Tyr, Trp and Cysteine (S-S bond) are entered in the e280Calc tab, the extinction coefficient values are calculated as e280 = 5500 x (Trp residues) + 1490 x (Tyr residues) + 125 x (cysteine S-S bond). The e280 value is used by the software for concentration calculation.
In addition to concentration determination of nucleic acids and protein, the BioSpec-nano can be used as an ultra micro-volume spectrophotometer for many other analytes or as a standard spectrophotometer using 5 mm pathlength cells.

This communication presents data on the accuracy and reproducibility of the BioSpec-nano UV-VIS spectrophotometer for dsDNA and protein quantitation. Even with ultra-small volumes (1 to 2 L), reproducibility is excellent, while the automated wiping function improves throughput and results in minimal carryover for more precise results.

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Nucleic Acid quantitation procedures have advanced significantly in the last three decades.  More and more, molecular biologists require consistent ...

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine cell central metabolism and discover new enzymes is 13C-assisted metabolism analysis 1. This technique is based on isotopic labeling, whereby microbes are fed with a 13C labeled substrates. By tracing the atom transition paths between metabolites in the biochemical network, we can determine functional pathways and discover new enzymes. 
As a complementary method to transcriptomics and proteomics, approaches for isotopomer-assisted analysis of metabolic pathways contain three major steps 2. First, we grow cells with 13C labeled substrates. In this step, the composition of the medium and the selection of labeled substrates are two key factors. To avoid measurement noises from non-labeled carbon in nutrient supplements, a minimal medium with a sole carbon source is required. Further, the choice of a labeled substrate is based on how effectively it will elucidate the pathway being analyzed. Because novel enzymes often involve different reaction stereochemistry or intermediate products, in general, singly labeled carbon substrates are more informative for detection of novel pathways than uniformly labeled ones for detection of novel pathways3, 4. Second, we analyze amino acid labeling patterns using GC-MS. Amino acids are abundant in protein and thus can be obtained from biomass hydrolysis. Amino acids can be derivatized by N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) before GC separation. TBDMS derivatized amino acids can be fragmented by MS and result in different arrays of fragments. Based on the mass to charge (m/z) ratio of fragmented and unfragmented amino acids, we can deduce the possible labeled patterns of the central metabolites that are precursors of the amino acids. Third, we trace 13C carbon transitions in the proposed pathways and, based on the isotopomer data, confirm whether these pathways are active 2. Measurement of amino acids provides isotopic labeling information about eight crucial precursor metabolites in the central metabolism. These metabolic key nodes can reflect the functions of associated central pathways.
13C-assisted metabolism analysis via proteinogenic amino acids can be widely used for functional characterization of poorly-characterized microbial metabolism1. In this protocol, we will use Cyanothece 51142 as the model strain to demonstrate the use of labeled carbon substrates for discovering new enzymatic functions.

Metabolic Pathway Confirmation and Discovery Through 13C-labeling of Proteinogenic Amino Acids

13C-isotope labeling is a useful technique for determining the cell central metabolism for various types of microorganisms. After cells have been cultured with a specific labeled substrate, GC-MS measurement can reveal functional metabolic pathways based on unique labeling patterns in proteinogenic amino acids.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Microbes have complex metabolic pathways that can be investigated using biochemistry and functional genomics methods. One important technique to examine ...

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern for governments, industries and medical professionals worldwide. For example, EHECs, combined with Shigella, are responsible for the deaths of approximately 325,000 children each year and are particularly prevalent in the developing world where laboratory-based identification, common in the United States, is unavailable 1. The development and distribution of low cost, field-based, point-of-care tools to aid in the rapid identification and/or diagnosis of pathogens or disease markers could dramatically alter disease progression and patient prognosis. We have developed a tool to isolate nucleic acids and proteins from a sample by solid-phase extraction (SPE) without electricity or associated laboratory equipment 2. The isolated macromolecules can be used for diagnosis either in a forward lab or using field-based point-of-care platforms. Importantly, this method provides for the direct comparison of nucleic acid and protein data from an un-split sample, offering a confidence through corroboration of genomic and proteomic analysis.
Our isolation tool utilizes the industry standard for solid-phase nucleic acid isolation, the BOOM technology, which isolates nucleic acids from a chaotropic salt solution, usually guanidine isothiocyanate, through binding to silica-based particles or filters 3. CUBRC's proprietary solid-phase extraction chemistry is used to purify protein from chaotropic salt solutions, in this case, from the waste or flow-thru following nucleic acid isolation4.
By packaging well-characterized chemistries into a small, inexpensive and simple platform, we have generated a portable system for nucleic acid and protein extraction that can be performed under a variety of conditions. The isolated nucleic acids are stable and can be transported to a position where power is available for PCR amplification while the protein content can immediately be analyzed by hand held or other immunological-based assays. The rapid identification of disease markers in the field could significantly alter the patient's outcome by directing the proper course of treatment at an earlier stage of disease progression. The tool and method described are suitable for use with virtually any infectious agent and offer the user the redundancy of multi-macromolecule type analyses while simultaneously reducing their logistical burden.

A tool and chemistries are described to sequentially isolate nucleic acids followed by proteins from a sample without the need for electricity. The tool consists of a sorbent held within a transfer pipette while the isolation chemistries are based on solid-phase extraction principles. The isolated macromolecules can be analyzed by immuno-based and PCR-based assays.

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures. Protocol 1 lists the set of instructions needed to download and install the software. This is followed, in Protocol 2, by the analysis of a nucleic acid structure, including the assignment of base pairs and the determination of rigid-body parameters that describe the structure and, in Protocol 3, by a description of the reconstruction of an atomic model of a structure from its rigid-body parameters. The most recent version of 3DNA, version 2.1, has new features for the analysis and manipulation of ensembles of structures, such as those deduced from nuclear magnetic resonance (NMR) measurements and molecular dynamic (MD) simulations; these features are presented in Protocols 4 and 5. In addition to the 3DNA stand-alone software package, the w3DNA web server, located at <a href="http://w3dna.rutgers.edu" target="_blank">http://w3dna.rutgers.edu</a>, provides a user-friendly interface to selected features of the software. Protocol 6 demonstrates a novel feature of the site for building models of long DNA molecules decorated with bound proteins at user-specified locations.

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic acid structures. This article presents detailed protocols for a subset of new and popular features available in 3DNA, applicable to both individual structures and ensembles of related structures.

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, and participate in various signaling pathways. Caenorhabditis elegans synthesizes all of the enzymes necessary to produce a range of omega-6 and omega-3 fatty acids. This, combined with the simple anatomy and range of available genetic tools, make it an attractive model to study fatty acid function. In order to investigate the genetic pathways that mediate the physiological effects of dietary fatty acids, we have developed a method to supplement the C. elegans diet with unsaturated fatty acids. Supplementation is an effective means to alter the fatty acid composition of worms and can also be used to rescue defects in fatty acid-deficient mutants. Our method uses nematode growth medium agar (NGM) supplemented with fatty acidsodium salts. The fatty acids in the supplemented plates become incorporated into the membranes of the bacterial food source, which is then taken up by the C. elegans that feed on the supplemented bacteria. We also describe a gas chromatography protocol to monitor the changes in fatty acid composition that occur in supplemented worms. This is an efficient way to supplement the diets of both large and small populations of C. elegans, allowing for a range of applications for this method.

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a useful model to explore the functions of polyunsaturated fatty acids in development and physiology. This protocol describes an efficient method of supplementing the C. elegans diet with polyunsaturated fatty acids.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

Sequence-specific Labeling of Nucleic Acids and Proteins with Methyltransferases and Cofactor Analogues

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific positions in DNA, RNA, proteins and small biomolecules. This natural methylation reaction can be expanded to a wide variety of alkylation reactions using synthetic cofactor analogues. Replacement of the reactive sulfonium center of AdoMet with an aziridine ring leads to cofactors which can be coupled with DNA by various DNA MTases. These aziridine cofactors can be equipped with reporter groups at different positions of the adenine moiety and used for Sequence-specific Methyltransferase-Induced Labeling of DNA (SMILing DNA). As a typical example we give a protocol for biotinylation of pBR322 plasmid DNA at the 5&#8217;-ATCGAT-3&#8217; sequence with the DNA MTase M.BseCI and the aziridine cofactor 6BAz in one step. Extension of the activated methyl group with unsaturated alkyl groups results in another class of AdoMet analogues which are used for methyltransferase-directed Transfer of Activated Groups (mTAG). Since the extended side chains are activated by the sulfonium center and the unsaturated bond, these cofactors are called double-activated AdoMet analogues. These analogues not only function as cofactors for DNA MTases, like the aziridine cofactors, but also for RNA, protein and small molecule MTases. They are typically used for enzymatic modification of MTase substrates with unique functional groups which are labeled with reporter groups in a second chemical step. This is exemplified in a protocol for fluorescence labeling of histone H3 protein. A small propargyl group is transferred from the cofactor analogue SeAdoYn to the protein by the histone H3 lysine 4 (H3K4) MTase Set7/9 followed by click labeling of the alkynylated histone H3 with TAMRA azide. MTase-mediated labeling with cofactor analogues is an enabling technology for many exciting applications including identification and functional study of MTase substrates as well as DNA genotyping and methylation detection.

DNA and proteins are sequence-specifically labeled with affinity or fluorescent reporter groups using DNA or protein methyltransferases and synthetic cofactor analogues. Depending on the cofactor specificity of the enzymes, aziridine or double activated cofactor analogues are employed for one- or two-step labeling.

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

S-Adenosyl-l-methionine (AdoMet or SAM)-dependent methyltransferases (MTase) catalyze the transfer of the activated methyl group from AdoMet to specific ...

Highly Efficient Ligation of Small RNA Molecules for MicroRNA Quantitation by High-Throughput Sequencing

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide resolution. This technique captures miRNAs by attaching 3&#8217; and 5&#8217; oligonucleotide adapters to miRNA molecules and allows de novo miRNA discovery. Coupling with powerful next-generation sequencing platforms, miR-Seq has been instrumental in the study of miRNA biology. However, significant biases introduced by oligonucleotide ligation steps have prevented miR-Seq from being employed as an accurate quantitation tool. Previous studies demonstrate that biases in current miR-Seq methods often lead to inaccurate miRNA quantification with errors up to 1,000-fold for some miRNAs1,2. To resolve these biases imparted by RNA ligation, we have developed a small RNA ligation method that results in ligation efficiencies of over 95% for both 3&#8217; and 5&#8242; ligation steps. Benchmarking this improved library construction method using equimolar or differentially mixed synthetic miRNAs, consistently yields reads numbers with less than two-fold deviation from the expected value. Furthermore, this high-efficiency miR-Seq method permits accurate genome-wide miRNA profiling from in vivo total RNA samples2.

MicroRNAs (miRNAs) are a widely conserved class of regulatory molecules. Here we describe a miRNA cloning method that relies upon two potent ligation steps followed by high-throughput sequencing. Our method permits accurate genome-wide quantitation of miRNAs.

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

MiRNA cloning and high-throughput sequencing, termed miR-Seq, stands alone as a transcriptome-wide approach to quantify miRNAs with single nucleotide ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi<em&gt; In Vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif^{13 C-etiketleme}

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi

Nükleik Asitlerin NanoDrop Microvolume kantitasyonu

Transkript

Özet

Daha Fazla Video Keşfet

Bu videodaki bölümler

NanoDrop 2000c Spektrofotometre kullanılarak Microvolume Protein Konsantrasyonu Tayini

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

Konsantrasyon belirlenmesi Micro hacimli Bio-spec Nano Spektrofotometre Nükleik Asitler ve Proteinler

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13 C-etiketleme

Elektrik-Free, Sıralı Nükleik Asit ve Protein İzolasyonu

3DNA ile Nükleik Asit Yapıları analiz ve Yapı

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi

Methyltransferases ve Kofaktör Analoglarının ile Nükleik Asitler ve Proteinler Dizi-spesifik Etiketleme

Yüksek Verim Dizilimine tarafından MicroRNA ölçümü için Küçük RNA molekülleri, yüksek Verimli ligasyonu

Endotel Hücre yapışma miktarının belirlenmesi

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif^{13 C-etiketleme}