Name: oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination
Uploaded: 2017-05-18T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av National Research Foundation of Korea-stipend finansiert av den koreanske regjeringen (MSIP) (nr. 2015R1A2A1A10052663 og nr. 2014M1A3A3A02034698).

1. Sikkerhet FORSIKTIG: Denne protokollen bruker [γ- 32 P] -ATP for å vurdere aktiviteten til AMPK. Fosfor-32 er en radioaktiv isotop, som i stor grad sender ut beta-stråling. Siden størrelsen på en beta-partikkel er ekstremt liten, kan den lett trenge inn i klær og hud. Både ekstern og intern eksponering for beta-stråling kan være skadelig for menneskers helse, blant annet ved å forårsake hudforbrenninger og vevskader. <ol><li> Utfør alle trinnene som krever bruk av...

<ol>
	<li>Hardie, D. G., Schaffer, B. E., Brunet, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK:+An+energy-sensing+pathway+with+multiple+inputs+and+outputs.">AMPK: An energy-sensing pathway with multiple inputs and outputs.</a> Trends Cell Biol. 26, 190-201 (2016).</li><li>Gwinn, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+phosphorylation+of+raptor+mediates+a+metabolic+checkpoint.">AMPK phosphorylation of raptor mediates a metabolic checkpoint.</a> Mol Cell. 30, 214-226 (2008).</li><li>Huang, H. C., Nguyen, T., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+of+Nrf2+at+Ser-40+by+protein+kinase+C+regulates+antioxidant+response+element-mediated+transcription.">Phosphorylation of Nrf2 at Ser-40 by protein kinase C regulates antioxidant response element-mediated transcription.</a> J Biol Chem. 277, 42769-42774 (2002).</li><li>Niture, S. K., Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antioxidant-induced+modification+of+INrf2+cysteine+151+and+PKC-delta-mediated+phosphorylation+of+Nrf2+serine+40+are+both+required+for+stabilization+and+nuclear+translocation+of+Nrf2+and+increased+drug+resistance.">Antioxidant-induced modification of INrf2 cysteine 151 and PKC-delta-mediated phosphorylation of Nrf2 serine 40 are both required for stabilization and nuclear translocation of Nrf2 and increased drug resistance.</a> J Cell Sci. 122, 4452-4464 (2009).</li><li>Jain, A. K., Jaiswal, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GSK-3beta+acts+upstream+of+Fyn+kinase+in+regulation+of+nuclear+export+and+degradation+of+NF-E2+related+factor+2.">GSK-3beta acts upstream of Fyn kinase in regulation of nuclear export and degradation of NF-E2 related factor 2.</a> J Biol Chem. 282, 16502-16510 (2007).</li><li>Steen, H., Jebanathirajah, J. A., Rush, J., Morrice, N., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+analysis+by+mass+spectrometry:+myths,+facts,+and+the+consequences+for+qualitative+and+quantitative+measurements.">Phosphorylation analysis by mass spectrometry: myths, facts, and the consequences for qualitative and quantitative measurements.</a> Mol Cell Proteomics. 5, 172-181 (2006).</li><li>Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+and+analysis+of+phosphorylation+sites:+a+quick+guide+for+cell+biologists.">Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists.</a> Mol Biol Cell. 24, 535-542 (2013).</li><li>Joo, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMPK+facilitates+nuclear+accumulation+of+Nrf2+by+phosphorylating+at+Serine+550.">AMPK facilitates nuclear accumulation of Nrf2 by phosphorylating at Serine 550.</a> Mol Cell Biol. 36, 1931-1942 (2016).</li><li>Sinclair, W. K., Holloway, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Half-lives+of+some+radioactive+isotopes.">Half-lives of some radioactive isotopes.</a> Nature. 167 (4244), 365 (1951).</li><li>Chang, B. Y., Chiang, M., Cartwright, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+interaction+of+Src+and+RACK1+is+enhanced+by+activation+of+protein+kinase+C+and+tyrosine+phosphorylation+of+RACK1.">The interaction of Src and RACK1 is enhanced by activation of protein kinase C and tyrosine phosphorylation of RACK1.</a> J Biol Chem. 276, 20346-20356 (2001).</li><li>Smith, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RACK1+interacts+with+filamin-A+to+regulate+plasma+membrane+levels+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">RACK1 interacts with filamin-A to regulate plasma membrane levels of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 305 (1), C111-C120 (2013).</li></ol>

Som en enkel og praktisk måte å vurdere ektheten av de forutsagte fosforyleringsstedene mediert av AMPK, beskriver vi en in vitro kinaseanalyse som kan brukes til å oppdage et spesifikt fosforyleringssted ved bruk av konkurrerende peptider og for å verifisere det ved bruk av en spesifikk mutant . Representative data oppnådd fra den in vitro- konkurrerende AMPK-aktivitetsanalysen matchet resultatene fra en analyse ved bruk av et stedrettet mutantprotein, hvilket indikerer at peptidkonkurranseanalys...

Proteinfosforylering ved en bestemt rest spiller en betydelig rolle i et bredt spekter av cellulære prosesser. En forståelse av signalnettverk krever således identifisering av spesifikke fosforyleringssteder. I tillegg bestemmer fosforyleringsstedet effekten på proteinfunksjonen fordi individuelle domener i et protein har forskjellige strukturer og funksjoner. Aktiviteten av nukleær faktor erythroid 2-relatert faktor 2 (Nrf2), en nøkkel antioxidant transkripsjonsfaktor, er toveis regulert gjennom fosforylering på forskjellige steder. Våre studier har fokusert på kinaser som katalyserer fosforyleringen av Nrf2. Spenningsresponsen av Nrf2 mot oksidativ utfordring skjer raskt, hovedsakelig gjennom fosforylering ved serin 40 og mediert av proteinkinase C (PKC) -δ, som aktiverer Nrf2 3 , 4 . Omvendt katalyserer Fyn den inhibitoriske fosforyleringen av Nrf2 ved tyrosin 568 for tett kontroll av aktiviteten 5 . Den vanligste metoden som brukes til å oppdage fosforyleringssteder er væskekromatografi / massespektrometrianalyse (LC / MS). Hurtig og svært sensitiv fosforyleringssted kartlegging data kan genereres på denne måten; Det har imidlertid flere tekniske begrensninger, som ofte genererer falsk-negative signaler. Dårlig sekvensdekning forekommer ofte i LC / MS analyse. For å identifisere fosforyleringssteder, er det nødvendig med opplysninger om maksimal aminosyredekning av et protein 6 . Proteolyse av proteinet av interesse med flere proteaser under fordøyelsestrinnet kan være til hjelp for å forbedre sekvensdekning. Et annet hinder for identifisering av fosforyleringsrester er det fatal tap av fosforsyre som ofte observeres for serin- og treonin-fosforylerte peptider 6 , 7 . Labile fosfatgrupper er ofteFrigjort fra fosfopeptider under fragmenteringsprosessen 7 . Det andre alternativet når man søker etter fosforyleringssteder, bruker en peptidmikroarray-metode. Det er mulig å skjerme for kinase-målstedene ved å bruke en mikroarray-chip som inneholder peptidfragmenter avledet fra et protein av interesse. På grunn av utstyrskravet for produksjon og deteksjon av en mikroarray-chip, anses peptidmikroarray-metoden imidlertid tidskrevende og kostbar. For å overvinne disse utfordringene kan en in vitro oligopeptidkompeterende kinaseanalyse brukes til en proteinkinase med kjente genkende motiver. Hvis konsensusgjenkjenningsmotivet for en kinase er etablert, kan man forestille formative fosforyleringssteder av et kandidatsubstrat, og autentisiteten til nettstedene kan valideres. Den mest overbevisende metoden for denne prosedyren er å vise opphevelsen av fosforylering i et mutantprotein der prediktenD-rest er substituert med en ikke-fosforylerbar aminosyre ( dvs. serin eller treonin til alanin, tyrosin til fenylalanin). Produksjonen og isoleringen av mutantproteiner er imidlertid tidkrevende. Som et alternativ i den første fasen av forskningen er konkurransedyktig peptidkinaseanalyse enkel og praktisk. Her beskriver vi en protokoll for en in vitro- peptidkonkurranseanalyse og for validering av fosforyleringsstedet.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HEPES</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA</td>
			<td>15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>208337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGTA</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>E3889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>D9779</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-glycerophosphate</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G9422</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>450243</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor cocktail</td>
			<td>Calbiochem, Nottingham, UK</td>
			<td>539134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A2383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMP</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>A1752</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AMPK</td>
			<td>Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY</td>
			<td>14-840</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nrf2 (WT)</td>
			<td>Abnova, Taipei City, Taiwan</td>
			<td>H00004780-P01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>[&#947;-32P]-ATP</td>
			<td>PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Waltham, MA</td>
			<td>NEG502A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EZblue staining reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td>
			<td>G1041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pfu turbo DNA polymerase</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>600250</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP mix</td>
			<td>Agilent Technologies, Santa Clara, CA</td>
			<td>200415-51</td>
			<td>Avoid multiple thaw and freezing cycle</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DpnI</td>
			<td>New England Biolabs, Ipswich, MA</td>
			<td>R0176S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB broth</td>
			<td>Duchefa Biochemie BV, Haarlem, Netherlands</td>
			<td>L1704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ampicillin</td>
			<td>Affymetrix, Santa Clara, CA</td>
			<td>11259</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose LE</td>
			<td>iNtRON Biotechnology, Sungnam, South Korea</td>
			<td>32034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HiYield Plus Gel/PCR DNA Mini Kit</td>
			<td>Real Biotech Corporation, Taipei, Taiwan</td>
			<td>QDF100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>161-0400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Bovogen Biologicals, Victoria, Australia</td>
			<td>BSA100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutathione Sepharose 4B</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>17-0756-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetic Acid glacial</td>
			<td>Duksan pure chemicals, Ansan, South Korea</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methyl alcohol</td>
			<td>Daejung Chemicals &#38; Metals, Siheung, South Korea</td>
			<td>5558-4410</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Typhoon FLA 7000</td>
			<td>GE Healthcare, Marlborough, MA</td>
			<td>28-9558-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE kit</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>1658001FC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum pump</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-178</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel dryer</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>165-1746</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dancing shaker</td>
			<td>FINEPCR, Seoul, Korea</td>
			<td>CR300</td>
			<td>The machine is needed for washing step</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR machine</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator/shakers</td>
			<td>N-BIOTEK, GyeongGi-Do, Korea</td>
			<td>NB-205L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuges</td>
			<td>LABOGENE, Seoul, Korea</td>
			<td>1730R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chromatography columns</td>
			<td>Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA</td>
			<td>732-1010</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

oligopeptide competition assay for phosphorylation site determination

Proteinfosforylering på bestemte steder bestemmer dens konformasjon og interaksjon med andre molekyler. Dermed påvirker proteinfosforylering biologiske funksjoner og egenskaper hos cellen. For tiden er den vanligste metoden for å oppdage fosforyleringssteder ved væskekromatografi / massespektrometri (LC / MS) analyse, en rask og sensitiv metode. Imidlertid frigjøres relativt labile fosfatgrupper ofte fra fosfopeptider under fragmenteringstrinnet, som ofte gir falske negative signaler. I slike tilfeller ville en tradisjonell in vitro kinaseanalyse ved bruk av stedrettede mutanter være mer nøyaktig, men denne metoden er arbeidskrevende og tidkrevende. Derfor kan en alternativ metode ved bruk av peptidkonkurranse være fordelaktig. Konsensusgjenkjenningsmotivet for 5&#39;-adenosinmonofosfat-aktivert proteinkinase (AMPK) er blitt etablert 1 og ble validert ved å bruke et posisjonsskanningspeptidbibliotek assAy 2 . Dermed kan AMPK-fosforyleringssteder for et nytt substrat forutsies og bekreftes ved peptidkonkurranseanalysene. I denne rapporten beskriver vi de detaljerte trinnene og prosedyrene for den in vitro oligopeptidkonkurrerende kinaseanalysen ved å illustrere AMPK-mediert atomfaktor erytroide 2-relatert faktor 2 (Nrf2) fosforylering. For å autentisere fosforyleringsstedet gjennomførte vi en sekvensiell in vitro kinaseanalyse ved bruk av en stedsspesifik mutant. Samlet gir peptidkonkurranseanalysen en metode for å skjerme multiple potensielle fosforyleringssteder og å identifisere steder for validering av fosforyleringsstedsmutanter.

Figur 1 og Figur 2 viser resultatene fra gjentatte eksperimenter i det tidligere rapporterte papiret 8 . Tre forskjellige oligoseptider med 10 residu som etterligner de formodede AMPK-målsteder (# 1, 148-157 omfattende Ser153; # 2, 330-339 omfattende Ser335; og # 3, 553-562 omfattende Ser558) ble syntetisert og anvendt som konkurrenter i den Vitro kinaseanalyse. Fosforyleringen av Nrf2 ved AMPK ble kraft...

Watch this Scientific Journal Video about Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination at JoVE.com

Oligopeptide Competition Assay for Phosphorylation Site Determination

Peptidkonkurranseanalyser er mye brukt i en rekke molekylære og immunologiske eksperimenter. Dette papiret beskriver en detaljert metode for en in vitro oligopeptid-konkurrerende kinaseanalyse og de tilhørende valideringsprosedyrer, som kan være nyttige for å finne spesifikke fosforyleringssteder.

Oligopeptidkonkurranseanalyse for fosforyleringsstedbestemmelse

Protein phosphorylation at specific sites determines its conformation and interaction with other molecules. Thus, protein phosphorylation affects ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Rapid Laser Probing Method Facilitates the Non-invasive and Contact-free Determination of Leaf Thermal Properties

En Rapid Laser Sondering Metode Forenkler Non-invasiv og berøringsfri Fastsettelse av Leaf termiske egenskaper

Plants can produce valuable substances such as secondary metabolites and recombinant proteins. The purification of the latter from plant biomass can be ...

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Effektiv og Site-spesifikke antistoff Merking av Strekk forfremmet Azid-alkyn cykloaddisjon

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Høy presisjon FRET ved enkeltmolekylivå for biomolekylstrukturbestemmelse

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Assay for Phosphorylation and Microtubule Binding Along with Localization of Tau Protein in Colorectal Cancer Cells

Analysen for fosforylering og Microtubule Binding med lokalisering av Tau Protein i tykktarmskreft celler

The microtubule-associated protein tau is a neuronal protein that localizes mostly in axons. Generally tau is essential for normal neuronal functioning ...

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay

Identifikasjon av Cyclin-avhengige Kinase 1 bestemt fosforylering områder av en In Vitro Kinase analysen

Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) is a master controller for the cell cycle in all eukaryotes and phosphorylates an estimated 8 - 13% of the proteome; ...

Identification of Functional Protein Regions Through Chimeric Protein Construction

Identifikasjon av funksjonelle Protein områder gjennom Chimeric Protein konstruksjon

The goal of this protocol encompasses the design of chimeric proteins in which distinct regions of a protein are replaced by their corresponding sequences ...

Human Peripheral Blood Neutrophil Isolation for Interrogating the Parkinson's Associated LRRK2 Kinase Pathway by Assessing Rab10 Phosphorylation

Humanperifert blod nøytrofil isolasjon for å forhøre Parkinsons tilknyttede LRRK2 Kinase Pathway ved å vurdere Rab10 fosforylering

The leucine rich repeat kinase 2 (LRRK2) is the most frequently mutated gene in hereditary Parkinson&#8217; disease (PD) and all pathogenic LRRK2 ...

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Site-Directed Mutagenesis for In Vitro and In Vivo Experiments Exemplified with RNA Interactions in Escherichia Coli

Nettstedet-rettet mutagenese for In Vitro og Vivo eksperimenter eksemplifisert med RNA samhandling i Escherichia Coli

Site-directed mutagenesis is a technique used to introduce specific mutations in DNA to investigate the interaction between small non-coding ribonucleic ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analyse for kvantitativ bestemmelse av palmitoylering av hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...

Nonradioactive Assay to Measure Polynucleotide Phosphorylation of Small Nucleotide Substrates

Ikke-radioaktiv analyse for å måle polynukleotidfosforylering av små nukleotids underlag

Polynucleotide kinases (PNKs) are enzymes that catalyze the phosphorylation of the 5&#39; hydroxyl end of DNA and RNA oligonucleotides. The activity of ...