Name: use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation
Uploaded: 2019-02-28T15:00:00
Duration: 12 min 9 s
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この研究は、シンガポール保健省の下にそのデザイナーデュオに R571-002-012-592, 国立研究財団 Investigatorship R571-000-272-281 デザイナーデュオに作成によって N.R.J.G. にその CBRG/0064/2014 年の下で国の医学研究評議会によって支えられました。。、、a. b. へのシンガポールのトランスレーショナル ・ リサーチ (星) 奨励賞 (ナノ材研/スター/013/2012)専門家細胞選別の NUS 免疫プログラム フロー中核施設から博士ポール ハッチンソンと氏テオ郭ヒュイに感謝しております。原稿の批判的読解のエリヤ陳に感謝しております。

著者は競争の興味を宣言しません。

提案するプロトコルは、人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化における分子間相互作用の解明の堅牢なツールを提供します。人間の T 細胞のアクティブ化中に co されるの調査のための重要なステップは、アゴニスト pMHC 細胞表面発現 pMHC Apc 共同アゴニスト pMHC 式の有無について等しいアゴニストを確保するための制御です。実験体制の共同アゴニスト pMHC アゴニストを構築し pMHC 定量化 TCR のような抗体10、を使用して supertransfection がそれに続く作動薬 pMHC の少量を表現する単一細胞クローンを使用して、これは、32. アゴニスト sc pMHC 式は、時間をかけて変更することが、TCR のような抗体を用いた実験で使用されている Apc のアゴニスト pMHC 表面式を定量化する重要です。特定の TCR のような抗体がない場合アゴニスト scMHC-蛍光タンパク質融合として表現できる、全内部反射蛍光顕微鏡などの機密性の高い顕微鏡法を使用しては、その細胞表面発現を定量化し、35,36しますさらに、共同作動薬 pMHC の細胞表面発現37CMV プロモーターのメチル化依存性および非依存を黙らせるために、時間をかけて減少し抗体染色と流れフローサイトメトリー解析を用いた監視する必要があります。繰り返し FACS の並べ替えに必要なとき。Sc pMHC 式の比較的限られた損失で最大 5 週間 CHO 細胞培養を行ったが。我々 はすぐに知られている sc MHC の発現と細胞の信頼性の高い在庫を確保するための選択/並べ替え後 CHO 細胞を凍結をお勧めします。
示されたプロトコルのいくつかの手順は、機器の可用性によって、または特定の研究目的に応じて変更できます。たとえば、PBMC 拡散潜在的なガンマ (または x) を必要としない方法を使用すると抑制 (ステップ 3.2.1) にすることができます照射、マイトマイシン C38による治療など。セル ステップ 3.3.1 でこするのではなく、金属キレート剤39を含む非酵素的細胞解離バッファーを使用できます。異なる Tcr 町細胞エクスプレス ハムスター MHC を表現する CTL クローン人間のクラス I の分子とこれらがここで学んだ CTL ラインの関連がより適しているように抗原提示システムを変更ことができますさらに、(図 2 aと。図 3 a、認められなかった融合 CHO 細胞 T 細胞応答)、他の人間の Tcr がありますいくつかの xenoreactivity を示す可能性があります。ハムスター β 2-microglubulin をノックして削減することができますまたは CRISPR/Cas9; を使用してをタップこと場合は、ハムスターの MHC のクラス I の式または CRISPR/Cas9 を介する β 2 microglubulin またはタップをノックアウトした後、人間の APC ラインを使用ことができます。
ここで紹介する実験システムは、事前定義されたペプチドを提示 MHC 分子と TCR および CD8 の相互作用の正確に制御できます。たとえば、我々 は以前にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞9,10coagonist を介した活性化促進を廃止 CD8 バインディング40 coagonist pMHC の突然変異に排除 TCR 廃止に対し共同作動薬 pMHC との相互作用には、coagonist を介した活性化強化10の影響はなかった。ただし、シングル チェーン MHC 構造の使用には、いくつか制限があります。たとえば、時間だし、複数プラスミドで異なるペプチドとその後 transfections 細胞選別と sc MHC の世代にこの実験のシステムを使用して複数の共同アゴニスト ペプチドをテストするのには手間のかかるシーケンスします。以前、マウス T 細胞活性化8,9, 複数共同アゴニスト ペプチドをテストにマウス タップ欠損細胞株 RMA-s を使用したが、このアプローチはタップ欠乏人間 T2 細胞ラインと10、最も可能性の高い成功しませんでした。タップに依存しないペプチド41に表現。実験体制のもう一つの制限は、T 細胞の活性化をトリガーするために必要な共同作動薬 pMHC の臨界量を決定する目的のため共同アゴニスト pMHC 分子の量を変更するための高速化手法を行いません。また、使用されるテトラサイクリン誘導システムでは許可されませんアゴニストの滴定単一セルのレベルで pMHC 数量テトラサイクリン濃度を変更するさまざまなテトラサイクリン濃度 HLA A2 陽性細胞の割合を変えるとなくセルごとごとに HLA A2 レベル。現在行っている別のアプローチ脂質二重膜42、以前マウス cd 4 + T 細胞活性化4中 co 作動を調査する使用を使用することですまたは提示定額でアゴニスト pMHC ビーズ、共同作動薬 pMHC のさまざまな量の存在。これらの代替実験系の共同作動薬 pMHC の量が異なると同様に、複数の共同アゴニスト ペプチド配列の高速テストように紫外線分解ペプチド技術4,43と組み合わせて使用すると、.
Sc MHC 技術は、単一のチェーン MHC クラス II 分子を提示済みペプチドは、哺乳類の細胞表面44に正常に表現されているように人間またはマウスの CD4 T 細胞の co されるの調査に適用もなることができます。また、sc MHC 技術の使用は HLA 大腸菌などの非古典的 MHC の分子の調査に拡張できます。Sc HLA-E は、前に記載されている、その表現45人間の T 細胞の活性化を阻害することが示されています。興味の別の非古典的 MHC 分子は CD1 ペプチド46の代わりに脂質を提示です。細胞表面に発現することと関連する脂質配位子47をバインドする CD1 重鎖と β 2-ミクログロブリンから成る Sc 構造が示されています。シングル チェーン MHC 技術 T および NK 細胞の活性化に分子間相互作用を調査するための調査ツールとして大きな可能性があります。

MHC のクラス I (MHC-私) 分子は各細胞で合成されるたんぱく質から派生した短い (8-10 アミノ酸) ペプチドを提示します。MHC-私の健康な細胞の分子存在自己ペプチドに由来する内因性のタンパク質です。ウイルス感染は、MHC に非自己ウイルス由来ペプチドのプレゼンテーションにつながる- けど、大量自己ペプチド-MHC (pMHC) の存在下でも感染細胞存在の非自己ペプチド。MHC-私が T 細胞受容体 (TCR) と T 細胞 CD8 共受容体で認識されます。TCR 親和性ペプチド pMHC には、CD8 バインディングはペプチドに依存しないに対し提示されたペプチドのシーケンスに大きく依存です。複雑な非自己アゴニスト pMHC に TCR バインディングは、T 細胞の活性化とエフェクターの機能に します。非刺激の自己 pMHC 複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが co される1,2,3と呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。マウス cd4 陽性 T 細胞4,5,6同様にマウスと人間 cd8 陽性 T 細胞7,8,9,10, Co されるが観察されています。11,12,13生理条件下で T 細胞が抗原提示細胞 (APCs) 共同提示最適な T に貢献するその co される示唆している非刺激 pMHC 錯体の高レベルの限られた数 pMHC アゴニストを認識する必要が。生体内で細胞の応答。総細胞表面の MHC クラス レベル ウイルス感染症14中と腫瘍15ダウンレギュ レートが多い。この免疫回避戦略アゴニスト pMHC プレゼンテーションを減少、また共同作動薬 pMHC の量を減らす私は T 細胞活性化強化のために利用できます。また、高い細胞表面 MHC の発現分子の HLA C が T 細胞の活性化で式に改良された HIV 制御16、総 MHC のクラスの重要な役割を示唆して関連付けるため示されている種します。Co される生理学的意義、にもかかわらずその分子機構はまだ不完全に理解されます。これは主に実験的アゴニスト pMHC を変えずに提示された共同作動薬 pMHC の量を制御する技術的な課題のためです。
実験を行った人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子の単一のポリペプチドとして前もって決定されたペプチドを提示 (単一のチェーン MHC-私は、図 1 a) 異種細胞で9,10 を行します。テトラサイクリン リプレッサー; を表現するハムスター由来の T-レックス町細胞株におけるテトラサイクリン誘導性プロモーターの制御の下で表現された単一のチェーン (sc) アゴニスト pMHCこれはテトラサイクリンとテトラサイクリン (図 1 b、C) の付加の後の高い sc アゴニスト pMHC 式の不在で sc 作動薬 pMHC の非常に低い「漏れやすい」表現ことができます。当時の sc アゴニスト pMHC 表現する T-レックス CHO 細胞非促進共同アゴニスト sc pMHC と supertransfected-(図 1 b、C) 恒常活性プロモーターの制御下で私。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の高レベルの存在の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。批判的に、以来、ペプチドと MHC-私重鎖は、scMHC にリンクされて共有-私はフォーマット、これにより、事前に決定されたペプチドを提示 MHC 分子に変異の紹介。ScMHC の使用-私技術はこうして特にアゴニストまたは共同作動薬 pMHC の TCR や CD8 バインディングのプロパティを調整することができました。
Cd 8 + T 細胞の活性化で Co されるは、精製された MHC を使用して観察されている-私提示アゴニストと共同アゴニスト ヘテロ11,の形でペプチド複合体17またはに提示量子ドット12,13。APC のアゴニスト pMHC 認識のコンテキストで cd 8 + T 細胞の活性化で共同作動の初期の作品は、Apc として TAP2 欠損細胞株を使用しました。タップは小胞体の細胞質からペプチド輸送に必要なタップ欠乏著しく低下利用可能な MHC クラス - 結合ペプチドのプール。ペプチドのない場合は、MHC の初期の複合体クラス I の重鎖と、β2- ミクログロブリンは安定して、非常に低い MHC の結果-携帯表面表現ですね。当初は、タップ十分・ RMA ヘテロ欠損マウスおよび RMA S セルラインに読み込まれる抗原で刺激された T 細胞の比較それぞれ、Apc は、明らかにしなかった co されるの任意の証拠マウス T 細胞活性化18中。しかし、この実験システムの使用は非刺激の自己 pMHC とは独立して表示作動薬 pMHC の量を正確に制御をできませんでした。さらに、これらの 2 つの細胞株は、T 細胞共刺激または抑制性の受容体にリガンドなどの T 細胞の活性化を調節する他の分子や接着分子の発現にも異なる場合があります。
その後、我々 は非刺激 pMHC の有無で定額作動薬 pMHC のプレゼンテーションを許可する外因性ペプチド TAP2 欠損 RMA S セルの読み込みのためのプロトコルを開発しました。これは次によって達成された: TAP2 欠損 RMA-S の潜伏は空の MHC を安定させるために (28 ° C、代わりに通常の 37 ° C) 低い温度で細胞クラス I 重いチェーン/β2ミクログロブリン錯体19;外因性アゴニスト ペプチドの 28 ° C の孵化外因性非促進ペプチドの存在の有無で 28 ° c の孵化空の MHC の細胞表面発現を減らすために 37 ° C で培養種複合体8,9。この実験のセットアップの使用では、非刺激 pMHC のプレゼンス強化マウス胸腺細胞、素朴な末梢血 cd8 陽性 T 細胞および Ctl8の活性化であることを明らかにしました。機械論的に、非刺激 pMHC の存在は、アゴニスト pMHC の不在でも T 細胞: APC 免疫シナプスに CD8 募集を引き起こすことができるし、非刺激 pMHC CD8 コレセプター7,8と TCR 相互作用を高めることができます。しかし、この実験システムはできませんと思います MHC クラスへ TCR や CD8 のバインドを変更する変更として活性化促進を媒介にアゴニストと共同アゴニスト pMHC する TCR および CD8 のコレセプター バインディングの相対的な貢献をテスト提示されたペプチドに関係なく、すべての MHC の分子に影響を与えます。したがって、この問題を克服するためにチェーンの技術を 1 つ MHC クラスを使用しました。
私は形式の単一のチェーン (sc) MHC クラス治療戦略のための抗原 pMHC プレゼンテーションを改善するために、TCR と NK 細胞受容体の活性化機構に関する基本的な質問に答えるし、20,21 の機能に使用されています。.scMHC-構成ペプチド、β2- ミクログロブリンと MHC-私重鎖は 2 つの柔軟なセリン/グリシンに富んだのリンカー (図 1 a) で参加している、いくつかの異なるリンカー配列されている開発および22のテストします。scMHC-私は複雑なタップとは関係なく折るし、従来の pMHC の複雑なアセンブリの20に必要なタンパク質のシャペロンします。scMHC-私が正しく、22を汚すコンホメーション特異抗体を用いて、x 線結晶構造解析23sc 構造を解くことによって折る示されています。基本的な scMHC-私低親和性ペプチド24,25の結合を改善するために設計が変更されています。
このプロトコルは、人間の scMHC の使用を説明します-ヒト CTL 中 co 作動を調査するクローンのアクティブ化。ヒト CTL クローン B 型肝炎ウイルス (HBV) の抗原のために特定のプロトコルを最適化されています。HBV は、世界中の厳しい医療負担 3 億 5000 万人が b 型肝炎と慢性 b 型肝炎感染に感染肝細胞癌 (HCC) の開発につながることができますがあります。HBV 感染から生じる肝細胞癌細胞 b 型肝炎ウイルス由来の抗原を提示することができます通常、特定の T 細胞によって認識することができます。B 型肝炎と肝クリアランスが人間の T 細胞の応答26に依存していますが、肝細胞癌患者は多くの場合 T 細胞の枯渇および減らされた T 細胞応答27苦しみます。慢性 HBV 感染症28を除去するために潜在的な免疫療法戦略として b 型肝炎ウイルス特定の TCR の HBV の T 細胞への導入を試みた。ただし、それは知られている場合このメソッドは表面の MHC の低レベルのため、臨床の現場で有効になります-ひと肝細胞29で。したがって、coagonism のメカニズムを理解することがあります別の視点 b 型肝炎での免疫療法のおそらく co 作動による T 細胞反応を誘導する内因性の pMHC のプレゼンテーションを強化しています。人間共同作動の研究のためのすべての必要な手順をカバーするプロトコル: アゴニストと共同アゴニストの sc pMHC、安定した T-rex 町細胞ラインの生成、HBV 固有ヒト CTL cd8 陽性 T 細胞株と CTL 活性化の文化と T レックス CHO 細胞のトランスフェクションサイトカイン産生と T レックス CHO 細胞への応答における脱顆粒の定量化実験。Sc MHC の使い方に焦点をクラス I の HBV の T 細胞の活性化中に co 作動を調査する技術、その提示方法簡単に適応できます T 細胞活性化の他の側面の研究のため知られている pMHC ヒト T 細胞系における留意しなければならない-私特異性。
このプロトコルを使用して、人間 cd8 CTL ライン特定 b 型肝炎ウイルス由来ペプチド E183 91 (FLLTRILTI:「E183」)30 HLA A2 に表示されます。sc HLA 分子が人間の β 2-ミクログロブリンから信号系列から成る、関心、グリシン/セリン リンカー、人間の β 2-ミクログロブリン、グリシン/セリン リンカーと重鎖は商業的にすることができます A2 の HLA A2 結合ペプチド合成 (図 1 a).リクエストに応じて著者からプラスミド アゴニスト E183 ペプチッド、または coagonist HIV ギャグ (SLYNTVATL)31ペプチド scA2 コンストラクトがあります。ペプチッド シーケンスは、サイト監督変異を使用して変更できます。テトラサイクリン誘導ベクトルに/pcDNA5 アゴニスト単一の鎖 HLA A2 E183 ペプチド (sc E183 HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン リプレッサー、pcDNA5 の存在下で/プラスミドにより興味の蛋白質の非常に低い、「漏れやすい」表現テトラサイクリン (図 1 b、C) の添加により、高発現を誘起することができます。テトラサイクリン誘導発現システムは、細胞表面のアゴニスト pMHC 発現量を制御できます。発現プラスミド pcDNA3.1 coagonist scA2 ギャグ ペプチド (sc ギャグ HLA A2) を表現するため。テトラサイクリン調節式 (T-レックス) 町セルライン (ハムスター細胞株、ない内生人間 MHC) は、アゴニストおよび共同アゴニストの sc HLA A2 構造を表現する使用されました。実験的なシステムにより、pMHC のプレゼンテーション (図 1) を正確に制御: pMHC プレゼンテーション (融合 T-レックス)、共同アゴニスト pMHC プレゼンテーション (構成 sc ギャグ HLA A2 式) の高額、低量アゴニスト pMHCプレゼンテーション (不在で sc E183 HLA A2 テトラサイクリン)、アゴニスト pMHC プレゼンテーション (テトラサイクリン存在下で sc E183 HLA A2) の高額、低量アゴニスト pMHC プレゼンテーションと共同作動薬 pMHC の高発現 (sc E183 HLA A2、テトラサイクリン、および構成 sc ギャグ HLA A2 式の不在)。実験的なシステム アゴニストと coagonist pMHC の細胞表面の量の正確なコントロールを使用します。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Aim-V (serum free media)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12055091</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>blasticidin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>R21001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytofix/Cytoperm (fixation/permealibisation kit)</td>
			<td>BD</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>F12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10565-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH3007103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>geneticin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10131035</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GolgiPlug (Brefeldin A)</td>
			<td>BD</td>
			<td>555029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hygromycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10687010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lectin from Phaseolus vulgaris (PHA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Opti-MEM (low serum media)</td>
			<td>Bibco</td>
			<td>31985070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 X PBS</td>
			<td>Vivantis</td>
			<td>PB0344 &#8211; 1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>polyethylenimine (PEI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>408727</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL2</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>202-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL7</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>207-IL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>recombinant human IL15</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>247-ILB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>tetracycline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T-REx CHO cell line</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>R71807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 x Trypsin/EDTA</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15400054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD3</td>
			<td>BD</td>
			<td>347347</td>
			<td>Clone SK7, RRID:AB_400287</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD8&#945;</td>
			<td>BD</td>
			<td>563795</td>
			<td>Clone RPA-T8, RRID:AB_2722501</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD107a</td>
			<td>BD</td>
			<td>566261</td>
			<td>Clone H4A3, RRID:AB_2739639</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HLA-A2</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>17-9876-41</td>
			<td>Clone BB7.2, RRID:AB_11151522</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IFN-&#947;</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-7319-41</td>
			<td>Clone 4S.B3, RRID:AB_1311250</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

use of single chain mhc technology to investigate co-agonism in human cd8+ t cell activation

非刺激自己ペプチッド MHC (pMHC) の複合体は T 細胞活性化とエフェクター機能を誘発しないでくださいが、co されると呼ばれるプロセスを介して、アゴニスト pMHC T 細胞応答を高めることができます。このプロトコルを記述する実験的人間 MHC の表現で人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化中に co 作動を調査するシステム クラス I の分子として前もって決定されたペプチドを提示単一のポリペプチド (単一のチェーン MHC) 異種細胞。アゴニスト単一のチェーン p MHC 複合体の低レベルと非刺激の単一チェーン p MHC 複合体の高レベルが表現された条件の下で単一のチェーン非自己を表現しました。本実験系の使用では、非刺激 pMHC の有無でアゴニスト pMHC に cd 8 + T 細胞の反応を比較することができました。プロトコルはセル行トランスフェクションを記述単一チェーン MHC 構造、安定したセルの世代ライン、B 型肝炎ウイルスに固有人間 cd8 陽性 T 細胞の培養 T 細胞活性化実験同時に定量化のサイトカイン産生とし脱顆粒。提示方法は知られているペプチッド MHC の特異性と人間の T 細胞における cd 8 + T 細胞活性化のさまざまな側面の研究のため使用できます。

Sc の MHC のクラス I ここで使用される技術により、MHC クラスの細胞表面発現の精密制御 T 細胞の活性化を誘導するために知られている、共有リンクのペプチドと私。(図 1、E) 共同作動薬 pMHC の有無で作動薬 pMHC の低レベルのプレゼンテーションを可能にする設計された異種 APC システム (図 1 a B、C) を生成します。批判的に、共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 (図 1E) の共発現による E183 HLA A2 は変わらないアゴニスト sc のプレゼンテーションを表示する HLA A2 提示 E183 ペプチドの特定の TCR のような抗体を使いました。しかし、E183 HLA A2 TCR のような抗体が HLA A2 提示ギャグ ペプチド (図 1E) いくつかのバインディングを示していますそれに注意する必要があります。異なるペプチッドまたは MHC の分子を使用して異なる特異性と人間の T 細胞の TCR やコレセプターの相互作用に必要な分子を調査する、同様に設計された抗原細胞システムを提示を構築できます。
我々 は、E183 HLA A2 特異的 cd 8 + T 細胞クローン人間を刺激するためにこれらの設計された Apc を使用しました。3 つの否定的なコントロールが使用された: T 細胞のみ、融合の T-レックス CHO 細胞と T レックス CHO 細胞 (融合の T-レックスの町で表現される任意の分子によって共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 潜在的な T をテストするための高い金額を表現する T-レックス CHO 細胞の細胞の活性化細胞 T 細胞のみと比較して)、sc ギャグ-HLA A2 (T レックス CHO 細胞融合の T-レックス CHO 細胞と比較して sc-ギャグ HLA-A2 の高レベルを表現) で T 細胞の活性化。融合の T-レックス CHO 細胞または sc ギャグ-HLA A2 を表現する T-レックス CHO 細胞を誘発しなかった E183 HLA A2 特異的 cd 8 + CTL クローンのアクティブ化 IFN-γ 産生と T 細胞の指標として脱顆粒マーカー CD107a の発現を定量化することで決定されます。細胞毒性 (図 2 a、B)。アゴニスト sc E183-HLA-A2、肯定的な制御、誘導非常に効率的な IFN-γ 産生および脱顆粒 (図 2 a, B)、として使用される特定の TCR がアクティブに sc HLA A2 構築を認識できることを示す高レベルの式T 細胞のエフェクター機能。Sc E183 HLA A2 の低レベルの発現誘導の IFN-γ 産生と脱顆粒, より低いレベル、これは共同アゴニスト sc ギャグ HLA A2 (図 2 a、B) の存在によって増強されました。CD107a + T 細胞の割合が非常に高いが抗原 pMHC (図 2 b)、アゴニスト pMHC T 細胞の誘導のための量のための比較的低い要件の以前の報告と矛盾の低レベルへの応答でも観察されたことが注意されなければなりません。細胞毒性33。単一のセル単位で顆粒の量を示す CD107a MFI は、優れたダイナミック レンジ (図 2 b) を提供します。T 細胞活性化の試金が使用できる 2 つの主要なエフェクターの機能の同時定量: サイトカイン生産と細胞毒性、良好なダイナミック レンジを非常に敏感な読み出しを提供します。
共同作動薬 pMHC に TCR バインディングが共同アゴニスト pMHC 依存性活性化強化のため必要かどうかをテストする単一のチェーン技術を使いました。我々 は突然変異 HLA A2 ペプチド結合溝 (図 3 b) の端に位置 152 でバリンを HLA A234TCR バインディングを廃止するこの突然変異が報告されているとグルタミン酸 V152E 変異体を作成します。V152E 突然変異はアゴニスト sc E183 HLA A2 にこの突然変異を導入し、T レックス CHO 細胞で突然変異体アゴニスト sc 構造を表現することによって、使用 E183 HLA A2 CTL クローンの TCR バインディングを廃止することができる場合、テストしました。野生のタイプ、しかしない V152E sc E183 HLA A2 には、E183 HLA A2 特定 CTL クローンを使用 (図 3 a) の活性化が誘導されます。MHC クラスのいずれかに TCR 結合変異として突然変異の効果の TCR と pMHC の複雑な正確な分子間相互作用に依存し、これらによって異なりますが、使用する個々 の TCR/T 細胞クローンの各を個別にテストする必要がある必要があります。異なる Tcr。たとえば、我々 は 8 つの変異をテスト、どちらかは以前 TCR 結合変異や HLA A2 にペプチド結合廃止せず TCR バインディングを混乱させることを予測した突然変異を報告しました。これらは、V152E だった E183 特定の T 細胞クローンのアクティブ化を廃止しただけの突然変異は10を使用します。共同アゴニスト sc ギャグ-HLA-A2 に V152E 突然変異を導入し、共同 WT または V152E sc ギャグ HLA A2 アゴニスト sc E183 HLA A2 の低レベルを表現しました。WT ・ V152E sc ギャグ HLA A2 強化、IFN γ 産生と脱顆粒 (図 3、D)、共同アゴニスト pMHC に TCR バインディングが共同アゴニスト pMHC 依存性 cd8 陽性 T 細胞活性化強化の必要がないことを示唆しています。シングル チェーン MHC クラス I の技術は、ここで示す、TCR はおよび/または T 細胞の抗原認識と活性化に必要な分子を調査するコレセプター MHC クラス I 知られているペプチド結合を変更するのには使用することができます。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig1.jpg"> 図 1: 単一のチェーン HLA A2 構築人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化における共同アゴニストを調査するために使用します。(A) 溶かされた人間 β2ミクログロブリン、選択、柔軟なグリシン セリン リンカー (GGGGSGGGGS GGGGS)、人間の β2ミクログロブリン、柔軟なペプチドから共有信号系列から成る scHLA A2 構造の模式図グリシン セリン リンカーと HLA A2 重鎖。(B) 人工抗原提示人間 cd8 陽性 T 細胞の活性化で co 作動を調査する細胞を生成するために使用するプラスミドの模式図: テトラサイクリン リプレッサー、テトラサイクリン誘導性プロモーターの制御下でアゴニスト sc E183 HLA A2非促進共同アゴニスト sc ギャグ HLA A2 恒常活性プロモーターの制御下で。(C) 設計の抗原提示細胞を使用して調査される co の模式図: T-レックス CHO 細胞 (ないのヒトの MHC の発現)、T レックスの CHO 細胞 (非促進共同アゴニスト pMHC) sc ギャグ HLA A2 の恒常高レベルを表現テトラサイクリン (アゴニスト ペプチドの低レベル) の不在で sc E183 HLA A2 の低い「漏れやすい」レベルを表現する T-レックス CHO 細胞、T レックス CHO 細胞 (アゴニスト ペプチドの高レベル)、テトラサイクリン存在下で sc E183 HLA A2 の高レベルを表現する T-レックス町細胞sc E183 HLA A2 の低レベルと高レベル sc ギャグ HLA A2 (アゴニスト ペプチドの低レベル) および共同アゴニスト ペプチドの高レベルを表現します。(D) セル設計された抗原抗 HLA A2 抗体を用いた細胞株を提示の表面の汚損します。示されている数字は、ライブセル ゲートの MHC 汚れの MFI の値を示します。データ設計抗原提示細胞を用いた HLA A2 提示 E183 ペプチドに対する特定の TCR のような抗体の細胞 5 独立実験 (E) 表面染色の代表。示されている数字は、ライブセル ゲートの MHC 汚れの MFI の値を示します。5 独立した実験の代表的なデータ。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3.jpg"> 図 2: サイトカイン産生および cd8 CTL クローン人間 E183 HLA A2 特有の脱顆粒共同作動薬 pMHC の存在が強化されています。(A) 細胞内インターフェロン-γ 3 h 刺激示された A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの染色抗原提示細胞を設計。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(B) 細胞は、CD107a 染色 A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローン後 3 h 刺激示された設計抗原提示細胞表面します。表示される番号は、CD107a 染色陽性の割合や cd8 陽性 T 細胞集団の CD107a MFI を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig2v3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59126/59126fig3.jpg"> 図 3: 共同アゴニスト-仲介された T 細胞活性化強化を複雑な共同アゴニスト pMHC に TCR バインド必要としません。(A) sc E183 HLA A2 の V152E 突然変異は E183 HLA A2 特定人間 cd8 CTL クローンのアクティブ化を廃止します。T-レックス CHO 細胞の高発現 (テトラサイクリン誘導) WT または V152E の突然変異体 sc E183 HLA A2 は、3 h の E183 HLA A2 特定人間 cd8 CTL クローンを刺激するために使用されました。T 細胞の活性化細胞の IFN-γ の染色を用いて定量化。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(B) HLA A2 のペプチド結合溝内 V152E の突然変異の場所です。(C) 複合 sc ギャグ HLA A2 共同作動薬 pMHC の V152E の突然変異に co agonist 依存性活性化強化廃止しません。細胞内インターフェロン-γ 染色 A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの 4 h 刺激示された後に、抗原提示細胞が設計されています。表示される番号は、IFN-γ の汚損のため割合陽性を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。(D) 複雑な sc ギャグ HLA A2 共同作動薬 pMHC の V152E の突然変異に co agonist 依存性活性化強化廃止しません。表面 CD107a を汚すセル A2 特定の HLA 人間 cd8 CTL クローンの 3 h 刺激示された抗原提示細胞に設計された後。表示される番号は、CD107a 染色陽性の割合や cd8 陽性 T 細胞集団の CD107a MFI を示します。3 独立した実験の代表的なデータ、技術をトリプリケートそれぞれ実行されます。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59126/59126fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

人間 cd8 T 細胞活性化における Co 作動を調査する単一のチェーン MHC 技術の使用

このプロトコルの使用を記述する単一のチェーンの MHC のクラス I 人間 cd8 陽性 T 細胞活性化の分子間相互作用を調査する錯体: 世代人工抗原提示単一のチェーンを表現する細胞の構築では、人間 cd8 陽性 T 細胞クローンの文化そして T 細胞活性化実験。

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

非刺激性ペプチドMHC複合体はT細胞を活性化しないが、アゴニストペプチドMHCに対するT細胞応答を増強することができる。このプロトコルは、ヒトCD8 T細胞活性化中の共アゴニズムを調査する実験システムを記述する。MHC分子を、共有結合重鎖、β-2-ミクログロブリン、ペプチドを持つ単鎖複合体として発現します。これにより、所定のペプチドを提示するMHC分子に変異を導入することができる。このプロトコルは、B型肝炎ウイルスのエピトープに特異的なヒトCTNクローンを使用する。肝炎に対するT細胞応答中の共アゴニズムのメカニズムを理解することは、このウイルス感染に対する免疫性刺激薬の開発に寄与する可能性がある。提示された方法は、既知のペプチドMHC特異性を有するヒトT細胞系におけるT細胞活性化の研究および他の基本的な側面に使用することができる。このプロトコルは、シグナル配列、目的とするペプチド、リンカー、ヒトβ-2-ミクログロブリンリンカー、およびMHC重鎖からなる単鎖ヒトMHCクラスI分子を使用する。B型肝炎由来のE1A3ペプチドはアゴニストペプチドとして使用される。HIVからのギャグは、非刺激ペプチドとして使用されます。単鎖ヒトMHC分子は、テトラサイクリンリプレッサーを含むハムスター細胞株で発現する。アゴニスト単鎖MHCはテトラサイクリン誘導性プラスミドを用いて発現し、テトラサイクリンの存在下では発現量が非常に低く、かつテトラサイクリンの存在下で高発現レベルを生じる。低レベルのアゴニストペプチドMHCを発現するCHO細胞は、構成的に非刺激性ペプチドMHCをトランスフェクトする。この実験システムの使用により、非刺激ペプチドMHCの存在下または非存在下でのアゴニストペプチドMHCに対するT細胞応答を比較することができる。この手順を開始するには、テキストプロトコルに概説されているように、T-75フラスコでCHO細胞を培養します。T細胞活性化実験の前日に、フラスコ中の細胞をPBSで洗浄する。PBSに05%トリプシンと2%EDTAを含む溶液を加え、室温で5~10分間インキュベートします。軽い顕微鏡を使って、細胞が切れ目が切れしていることを確かめる。次に、フラスコに完全なF12を加えてトリプシン化を停止します。細胞懸濁液を15ミリリットルのチューブに移します。400Gで5分間遠心分離機を使用し、ピペットまたはデカントで上清を除去します。完全なF12の5ミリリットルで細胞ペレットを再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、CF12で細胞濃度を1ミリリットル当たり200,000細胞に調整します。テトラサイクリン1ミリリットル当たり50~60ナノグラムをアゴニストのみのサンプルに加え、陽性対照として大量のアゴニストpMHCクラスI発現を誘導する。この後、CHO細胞をボルテックスまたはピペットで混合します。U-底96ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液の100マイクロリットルを追加します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベート。実験の前日、遠心分離機CTLS細胞はGの400倍、摂氏4度で5分間である。ヘモサイトメーターを使用して細胞を数え、サイトカインやPHAを使用せずに完全なヒトT細胞培地で1ミリリットル当たり100万個の細胞の密度で再中断します。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩CTLをインキュベートする。翌日、T細胞をGの400倍、摂氏4度で5分間遠心分離する。上清を捨て、2ミリリットルの完全な無血清培地で細胞を再懸濁する。ヘモサイトメーターを使用してT細胞を数え、完全なヒトT細胞培地で1ミリリットル当たり100万個の生細胞に密度を調整します。抗ヒトCD107a抗体を1~100希釈で、ブレフェルディンAを1~1000希釈で添加する。次に、CHO細胞を含む96ウェルプレートを回収する。ガラスパスツールピペットを使用して、CHO細胞から培地を吸引する。T細胞懸濁液の200マイクロリットルを各ウェルに加えます。T細胞を37°CでCHO細胞と共培養し、5%の二酸化炭素を3〜4時間共存させた。コカルチャーの終わりに、96ウェルプレートをG400倍、摂氏4度で5分間遠心分離する。吸引またはフリックして上清を取り除く。次に、2.5マイクロリットルのCD3抗体と2.5マイクロリットルのCD8抗体をPBSの50マイクロリットルの5%BSAに各ウェルに加え、細胞表面抗原染色のために、ピペット処理によって混合する。サンプルを暗闇の中で、氷の上で30分間インキュベートします。この後、各ウェルに150マイクロリットルの洗浄バッファーを加えてサンプルを洗浄します。サンプルをGの400倍、摂氏4度で5分間遠心する。吸引またはフリックして上清を取り除く。固定/透過性キットをセットし、各ウェルに100マイクロリットルの固定/透過性溶液を加え、混合するピペットを加えます。氷の上で20分間インキュベートします。その後、プレートを摂氏4度で400倍Gで5分間遠心する。上清を捨て、各ウェルに1Xパーマ/ウォッシュバッファの200マイクロリットルを追加します。遠心からパーマ/ウォッシュバッファを1回追加して、このプロセスを繰り返します。この後、抗インターフェロンガンマを含むパーマ/ウォッシュバッファーの50マイクロリットルで、1ミリリットル当たり3マイクログラムの濃度で細胞を再懸濁します。暗闇の中で氷の上で30分間インキュベートします。次に、1Xパーマ/ウォッシュバッファの150マイクロリットルを加えます。400G、摂氏4度の遠心分離機、5分間。上清を取り除き、1Xパーマ/ウォッシュバッファの200マイクロリットルを追加します。400倍G、摂氏4度で再びプレートを5分間遠心し、吸引またはフリックして上清を取り除きます。200マイクロリットルの洗浄バッファーでサンプルを再中断し、細胞測定分析を進めます。実験の1日前に、CHO細胞をボルテックスまたはピペットで混合します。次に、12ウェルプレートの各ウェルに細胞懸濁液を1ミリリットル加えます。5%の二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベート。実験当日は、セルスクレーパーを使用してCHOセルを各ウェルの底部から取り外します。各ウェルからFACSチューブに細胞を含む培地の1ミリリットルを移す。400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間。洗浄バッファーに希釈した抗 HLA 抗体の 100 マイクロリットルで再中断します。氷の上で30分間インキュベートします。次に、各CHOサンプルに1ミリリットルの洗浄バッファーを加えます。400倍Gで遠心分離機、摂氏4度で5分間、上清を捨てます。各サンプルを3ミリリットルの洗浄バッファーに再中断し、フローサイトメトリー分析に進みます。本研究では、ヒトCD8陽性T細胞活性化中の分子相互作用の研究のための堅牢なツールが提示される。共アゴニストpMHCの存在下または不在で低レベルのアゴニストpMHCを提示する、設計された異種システムが生成される。これらの設計されたAPCはE183特異的ヒトCD8陽性T細胞クローンを刺激するために使用される。非感染CHO細胞、および非刺激性単鎖Gag-MHC複合体を発現するCHO細胞は活性化を誘導しない。陽性対照であるアゴニスト単鎖E183-MHC複合体の高レベルの発現は、非常に効率的なインターフェロン-γ産生を誘導し、脱顆粒化することが見られ、単鎖E183構築物がT細胞エフェクター機能を活性化するために特定のTCRによって認識できることを実証する。シングルチェーンE183-MHC複合体の低レベルの発現は、非刺激性Gag-MHC複合体の存在によって増強されたインターフェロンガンマ産生および脱顆粒の低レベルを誘導する。なお、CD107a+T細胞の割合は、低レベルの抗原pMHCに応答しても観察されており、これは以前の研究と一致している。しかし、非刺激性Gag-MHC複合体の存在は、CD107a MFIを増加させる。この手順の間、非刺激ペプチドの有無にかかわらず等しいアゴニストの提示を確実にするために、アゴニストペプチドMHC発現を制御することが重要である。各実験においてTCR様抗体を用いてアゴニストペプチドMHC発現を定量化することが重要です。代替アプローチは、支持された脂質二重層、またはビーズを用い、非刺激ペプチドMHCの存在下で一定量のアゴニストペプチドMHCを提示する。これらの実験システムは、共アゴニズムのための複数の非刺激ペプチド配列のテストを可能にする必要があります。単鎖MHC技術はCD4 T細胞活性化における分子相互作用を調べるとともに、非古典的なMHC分子を調べるのに使用することができる。このプロトコルは、人間の血液とヒト細胞を使用しています。血液媒介性疾患の伝染のリスクを減らすために人間の血液を扱うときに必要なすべての予防措置に従ってください。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

マウスT細胞におけるT細胞受容体のレトロウイルス導入

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

Use of Interferon-&gamma; Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

Use of Interferon-ÃƒÅ½Ã‚Â³ Enzyme-linked Immunospot Assay to Characterize Novel T-cell Epitopes of Human Papillomavirus

ヒトパピローマウイルスの新規T細胞エピトープを特徴付けるために、インターフェロン-γ酵素結合Immunospotアッセイの使用

A protocol has been developed to overcome the difficulties of isolating and characterizing rare T cells specific for pathogens, such as human ...

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

Induction of Graft-versus-host Disease and In Vivo T Cell Monitoring Using an MHC-matched Murine Model

移植片対宿主病の誘導および<emインビボで&gt;</emMHCマッチしたマウスモデルを使用する&gt; T細胞のモニタリング

Graft-versus-host disease (GVHD) is the limiting barrier to the broad use of bone marrow transplant as a curative therapy for a variety of hematological ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

プライマリーヒトT細胞のpiggyBacトランスポゾンシステムの変更

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

The Use of Fluorescent Target Arrays for Assessment of T Cell Responses In vivo

T細胞応答の評価のための蛍光ターゲット配列の使用<em&gt;インビボ</em

The ability to monitor T cell responses in vivo is important for the development of our understanding of the immune response and the design of ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ヒト全血中のナチュラルキラー細胞溶解活性のフローサイトメトリー分析

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

サル免疫不全ウイルス特異的CD8の分析<sup&gt; +</sup&gt;ペプチドMHC-I四量体染色によりアカゲザルにおけるT細胞

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Highly Multiplexed, Super-resolution Imaging of T Cells Using madSTORM

madSTORMを用いたT細胞の高度に多重化された超解像イメージング

Imaging heterogeneous cellular structures using single molecule localization microscopy has been hindered by inadequate localization precision and ...

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

In Situ MHC-tetramer Staining and Quantitative Analysis to Determine the Location, Abundance, and Phenotype of Antigen-specific CD8 T Cells in Tissues

その場でMHC テトラマー染色と場所、豊富と組織における抗原特異的 cd8 陽性 T 細胞の表現型を決定するための定量解析

T cells are critical to many immunological processes, including detecting and eliminating virus-infected cells, preventing autoimmunity, assisting in ...